Histologische und funktionelle Charakterisierung von primären Keratinozytenkulturen aus dem Läsionsgebiet schwerstverbrannter Patienten

Einleitung:In der Vergangenheit wurden Keratinozyten lediglich als Träger des epidermalen Rahmengerüsts angesehen. Heute weiß man, dass die Keratinozyten eine Vielzahl biologisch bedeutsamer Moleküle sezernieren, mit denen sie bedarfsweise aktiv und wesentlich an vielen, insbesondere entzündlichen und immunologischen Reaktionen mitwirken. Daher sind Proliferation und Immunaktivierung bei Keratinozyten nicht prinzipiell gekoppelt. Seit 1981 werden kultivierte epitheliale Transplantate (KETs) zur Behandlung von Brandverletzten eingesetzt. Neben autologem Material, das erst spät verfügbar ist, erlangen kryokonservierte allogene Keratinozytentransplantate, vor allem bei Schwerbrandverletzten, immer mehr an Bedeutung. Allogene KETs beschleunigen die Heilung thermischer Wunden. Allerdings verbleiben sie nicht dauerhaft auf der Wunde, sondern werden schrittweise durch autologe Zellen ersetzt. Ihr Effekt könnte deshalb auf der Exprimierung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren beruhen. Material und Methode:Das Ziel vorliegender Studie war, vergleichend die zelluläre Zusammensetzung allogener KETs aus Mammareduktionsmaterial mit autologen aus wundnah gewonnenem Material Schwerstverbrannter zu untersuchen. Ausserdem sollten funktionelle Veränderungen hinsichtlich des in vitro Sekretionsmusters ausgewählter Mediatoren nach 5-, 10- und 15-tägiger Kultur, sowie nach Kryokonservierung charakterisiert und mit dem klinischen Verlauf korreliert werden. Die Erhebung der immunhistologischen Befunde erfolgte an gefärbten Zytospins nach HE- bzw. ABC-Methode. Zytokine und Wachstumsfaktoren in den Überständen der Keratinozytenkulturen wurden mit Bioplex Immunoassays quantifiziert. Die beiden Untersuchungskollektive stellten 17 Verbrennungspatienten mit > 25% TBSA, Grad II und/oder III und 17 zufällig ausgewählten Patientinnen, die sich einer Brustverkleinerung unterzogen. Resultate: Eine exemplarisch durchgeführte Histologie allogener KETs aus Mammareduktionsmaterial zeigte morphologisch heterogene Keratinozyten mit einem deutlich erhöhten Anteil terminal differenzierter suprabasaler Zellen, verglichen mit autologen aus Patientenmaterial (CK 10, 11 positiv). In den autologen Transplantaten waren gegenüber den allogenen vermehrt teilungsaktive Basalzellen nachweisbar (CK 5, Vimentin positiv). Leukozyten, Makrophagen, Dendritische Zellen, Endothelzellen und Fibroblasten konnten in autologen und allogenen KETs nicht nachgewiesen werden. IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IFN-g und TNF-a waren in den allogenen und autologen KET-Überständen nicht oder lediglich in Spuren nachweisbar. IL-1RA konnte in den Kulturen beider Gruppen in hohen Konzentrationen nachgewiesen werden. Die Sekretionsleistung von IL-6 und GM-CSF (Proliferationsschub der Keratinozyten, Chemotaxin) nach Verbrennungstrauma war während der ersten 15 Kultivierungstage gegenüber der Kontrollgruppe signifikant erhöht. Insbesondere die Gruppe der verstorbenen Patienten zeigte deutlich höhere Konzentrationen dieser Mediatoren in den Kulturüberständen während der ersten 15 Kulturtage im Vergleich zur Gruppe der überlebenden Patienten. VEGF, FGF-basic, TGF-ß und G-CSF zeigten in ihrem Sekretionsverhalten nur vergleichsweise minimale Unterschiede zwischen den beiden Kollektiven. Die Kryokonservierung führte zu einer verminderten Mediatorensynthese, mit Ausnahme signifikant erhöhter Konzentrationen der intrazellulär gespeicherten Mediatoren IL-1a und IL-1ß in der 24-stündigen Kultur nach dem Auftauen. Sie sind offensichtlich das Ergebnis physikalischer Freisetzung durch Zelldestruktion. Diskussion: Schweres Verbrennungstrauma führt zu einer erhöhten Teilungsaktivität von wundnahen epidermalen Basalzellen mit konsekutiv gesteigerter Mediatorenfreisetzung. Insbesondere die signifikant erhöhte in vitro Freisetzung des potenten Mitogens und proinflammatorischen Zytokins Interleukin-6 aus Keratinozyten nach schwerer Verbrennungsverletzung, verglichen mit solchen aus Mammareduktionsmaterial, ist ein deutlicher Hinweis, sowohl auf das entzündliche Geschehen, als auch auf die erhöhte Aktivität der thermisch beeinträchtigten Epithelzellen mit auto- und parakrinen Wirkungen