Herstellung von Insertions- und Deletionsmutanten des murinen Zytomegalievirus und deren Untersuchung in vitro und in vivo

Das humane Zytomegalievirus (HCMV) ist ein speziesspezifisches, humanpathogenes Herpesvirus. Ein etabliertes System zur Untersuchung der CMV-Infektion in vivo ist das murine Zytomegalievirus (MCMV). Das 230 kb große Genom von MCMV liegt seit kurzem als bakterielles artifizielles Chromosom (BAC) kloniert vor. Damit eröffnen sich neue Strategien für gentechnologische Untersuchungen, die Gegenstand dieser Dissertation sind: Mit homologer Rekombination in E. coli und mit Transposonmutagenese wurden Insertionsmutanten und Deletionsmutanten des MCMV hergestellt und in NIH 3T3 Fibroblasten in vitro sowie BALB/c Mäusen in vivo charakterisiert. Insertionsmutanten: Zwei verschiedene sezernierbare und quantitativ nachweisbare Markergene (HBsAg; SEAP) wurden jeweils so in das MCMV-Genom inseriert, dass sie im Rahmen einer Infektion in vitro wie auch in vivo zur Expression kommen. Im Versuchstier korrelierte die Menge der in das Serum sezernierten Marker hochgradig mit mit den Virustitern in Milz und Leber. Die Markersekrtetion wurde mit einer hierfür neu etablierten quantitativen PCR-Methode (TaqMan™) bezüglich der Sensitivität verglichen. Bei immunkompetenten Mäusen war SEAP – vor der PCR und der Virusbestimmung - das empfindlichste Nachweisverfahren. Die entwickelten Methoden erlauben erstmals die longitudinale Beobachtung einer MCMV-Infektion in ein- und- demselben Versuchstier. Deletionsmutanten: Das Wachstumsverhalten von 576 MCMV-Transposon-Mutanten in Fibroblasten wurde analysiert. Identifiziert wurden 19 Mutanten mit wachstumsdefizitären Phänotypen, denen Veränderungen von sechs offenen Leserahmen (ORF) zugrunde lagen. Eine Trunkierung eines dieser bisher nicht näher definierten, offensichtlich nicht essentielle Gene, bewirkt ein signifikantes, quantifizierbares Wachstumsdefizit. Mit Hilfe von elektronen-mikroskopischen Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass bei MCMV die Destruktion des Leserahmens M76 ein Exportdefizit aus dem Zellkern zur Folge hat