DdEB1, DdMoe1 und DdLIS1: drei neue, centrosomale und Mikrotubuli-assoziierte Proteine bei Dictyostelium discoideum

Die Organisation und Dynamik des Mikrotubuli-Cytoskeletts wird von großen Proteinkomplexen an den plus- und minus-Enden der Mikrotubuli reguliert. Am minus-Ende befindet sich das Centrosom, das als Mikrotubuli-organisierendes Zentrum dient. Am plus-Ende der Mikrotubuli findet sich ein Komplex von Proteinen, der die Dynamik der Mikrotubuli reguliert sowie ihre Verankerung am Zellcortex vermittelt. DdCP224 ist ein centrosomales und Mikrotubuli-assoziiertes Protein bei Dictyostelium discoideum, das zur ubiquitären XMAP215-Familie gehört und eine wichtige Rolle bei der Dynamik des Centrosoms und des Mikrotubuli-Cytoskeletts spielt. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung zuvor unbekannter Dictyostelium-Proteine, die mit DdCP224 bei diesen dynamischen Vorgängen zusammenwirken. Mit DdEB1, DdMoe1 und DdLIS1 konnten drei neue Mikrotubuli-assoziierte Proteine bei Dictyostelium identifiziert und charakterisiert werden. Alle drei Proteine konnten gleichzeitig auch als echte centrosomale Bestandteile nachgewiesen werden, da ihre Lokalisation am Centrosom unabhängig von Mikrotubuli ist. DdEB1 ist aufgrund seines Molekulargewichts, das größte Mitglied der ubiquitären EB1-Proteinfamilie. DdEB1 zeigte eine cytosolische Interaktion mit DdCP224 und Dynein. Am Beispiel von DdEB1 und DdCP224 konnte in dieser Arbeit nicht nur erstmals die Interaktion von Proteinen aus der EB1- und XMAP215-Familie, sondern auch ihre lange vermutete Colokalisation an Mikrotubuli-plus-Enden nachgewiesen werden. Mit Hilfe der Expression von GFP-DdEB1-Deletionsmutanten konnte gezeigt werden, dass die DdEB1 Bindung an Mikrotubuli von einer Homo-Oligomerisierung des Proteins abhängt, die durch eine „coiled-coil“-Domäne vermittelt wird. DdEB1-Nullmutanten zeigen in erster Linie mitotische Defekte, d.h. Störungen der Centrosomenduplikation, Spindelbildung und Chromosomensegregation. Die mikroskopische Analyse lebender Zellen ergab, dass DdEB1 für die Spindelbildung, nicht aber für die Spindelelongation oder die Mikrotubuli/Zellcortex-Interaktion benötigt wird. Bei der Suche nach möglichen DdEB1-Interaktoren wurde mit DdMoe1 das Dictyostelium-Homologe von Schizosaccharomyces pombe Moe1 isoliert, das dort ein Interaktionspartner des entsprechenden EB1-Proteins ist. Eine solche Interaktion ist den durchgeführten Untersuchungen zufolge bei Dictyostelium jedoch unwahrscheinlich. Dafür konnte hier zum ersten mal ein Moe1-homologes Protein als echte Centrosomenkomponente identifiziert werden und die Mikrotubuli-Bindung eines solche Proteins in vivo nachgewiesen werden. Wie EB1 ist auch das humane LIS1-Protein ein Mikrotubuli-plus-End und Dynein-assoziiertes Protein. Mutationen in diesem Gen führen zu einer schweren Entwicklungsstörung des Gehirns (Lissenzephalie), aufgrund eines neuronalen Migrationsdefekts. Dictyostelium LIS1 (DdLIS1) bindet nicht nur an Dynein, sondern auch an DdCP224, womit auch erstmals die Interaktion mit einem Protein der XMAP215-Familie nachgewiesen werden konnte. DdLIS1 spielt gemeinsam mit Dynein eine Rolle bei der Mikrotubuli/Zellcortex Verankerung, was in DdLIS1-Überexpressionsmutanten deutlich wurde. Die Überexpression von DdLIS1 führte außerdem zur Centrosomenamplifikation, Defekten bei der Organisation der Mitosespindel, schweren Cytokinesedefekten und einer drastisch eingeschränkten Zellmotilität. Letztere steht im Einklang mit dramatischen Veränderungen der Aktindynamik, bei der charakteristische wandernde Aktin-Polymerisationswellen am Zellcortex auftreten. Da derselbe Aktin-Phänotyp auch durch Behandlung von Kontrollzellen mit der F-Aktin depolymerisierenden Droge Latrunculin A simuliert werden konnte wurde angenommen, dass die DdLIS1-Überexpression den Aktin-Gehalt beeinflusst. Tatsächlich konnte in mikroskopischen und biochemischen Nachweisen bestätigt werden, dass die Überexpression von DdLIS1 den F-Aktin Gehalt der Zellen vermindert. Das Mikrotubuli-assoziierte Protein DdLIS1 ist also ein mögliches Bindeglied zwischen dem Mikrotubuli- und Aktin-Cytoskelettsystem