Analyse von Protein-Protein Interaktionen im Typ IV Sekretionssystem von Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens ist ein Gram-negatives Bodenbakterium, das dikotyle Pflanzen infiziert. Mittels eines Typ IV Sekretionssystems werden dabei ein Teil der bakteriellen DNA (T-DNA), sowie die Virulenzproteine VirE2, VirE3, VirD2 und VirF in die pflanzliche Zelle transferiert. Das Typ IV Sekretionssystem von A. tumefaciens besteht aus den 12 Vir-Proteinen VirB1-VirB11 und VirD4, die zu einem die äußere und innere Membran durchspannenden Proteinkomplex und einem Pilus (T-Pilus) assemblieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Protein-Protein-Interaktionen im VirB/D4-Sekretionssystem von A. tumefaciens C58 analysiert, mit dem Ziel einer Aufklärung der Assemblierung von Transporterstruktur und T-Pilus. Ergebnisse: 1) Unter Verwendung des milden nicht-ionischen Detergenz n-Dodecyl-b-D-maltosid wurde eine potentielle Vorstufe der T-Pilus Assemblierung solubilisiert. In dem ca. 100 kDa großen Proteinkomplex wurden die Vir-Proteine VirB2, VirB3, VirB5, VirB6, VirB7, VirB8 und geringe Mengen VirB9 detektiert. Die T-Pilus Proteine VirB2, VirB5 und VirB7 zeigten bei Analyse mittels BN-PAGE und 2D-Gelelektrophorese eine Kofraktionierung. Unter Berücksichtigung bereits bekannter Fakten wurde ein Modell der T-Pilus Assemblierung wurde erstellt. 2) Ein 27 kDa großes, mit VirB5 interagierendes Protein wurde entdeckt und nach Aufreinigung und N-terminaler Sequenzierung als „trans-Zeatin produzierendes Protein“ (Tzs) identifiziert. Die Untersuchung der enzymatischen Aktivität von Tzs ergab eine Umsetzung von 4-Hydroxy-3-methyl-2-(E)-butenyldiphosphat (HMBPP) mit AMP zu Zeatinribosid-5´-monophosphat (ZMP), einem Phytohormon der Cytokinin-Klasse. HMBPP ist ein Zwischenprodukt des alternativen Isoprenoid-Biosynthese Weges (DXP-Weg) Gram-negativer Bakterien. 3) Eine Interaktion von VirB5 mit VirB5, sowie VirB5 mit VirE2 konnte gezeigt werden. Im Rahmen der Analysen wurde neben den Piluskomponenten VirB2, VirB5 und VirB7 auch VirB1 in isolierten T-Pili detektiert