Identifizierung und Charakterisierung von Proteasen der Photosynthesemembran

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem proteolytischen System des Chloroplasten höherer Pflanzen und hier speziell mit dem des Thylakoidsystems. Vorderstes Ziel war die Isolierung und Charakterisierung neuer, bislang unbekannter Komponenten. Zu diesem Zweck wurden zwei unterschiedliche Ansätze erprobt: Einmal der rein biochemische Weg, bei dem der Versuch unternommen wurde, speziell lichtinduzierte proteolytische Aktivitäten des Thylakoidlumens nachzuweisen, anzureichern, und, falls möglich, aufzureinigen. Mit dem zweiten Ansatz wurde zunächst versucht, in Sequenzvergleichen auf molekularbiologischer Ebene homologe Gene zu bekannten bakteriellen und cyanobakteriellen Proteasen im pflanzlichen Genom ausfindig zu machen, und ausgehend von diesen dann die zugehörigen Genprodukte zu isolieren und charakterisieren. 1. Nachweis, Charakterisierung und Aufreinigung lichtstreßinduzierter Proteasen des Thylakoidlumens: Die zu diesem Ansatz durchgeführten Experimente konnten im Thylakoidlumen von Erbsenchloroplasten durch den Einsatz von Aktivitätstests auf substrathaltigen Polyacrylamidgelen mindestens fünf distinkte proteolytische Aktivitäten sichtbar machen. Diese Aktivitäten erwiesen sich als eindeutig induzierbar durch Hochlicht. Sie wurden jedoch sämtlich durch in äußerst geringer Menge vorliegende Komponenten des Lumens hervorgerufen. An der dadurch, sowie zusätzlich durch einen Lichtadaptationseffekt des Pflanzenmaterials, bedingten schlechten Reproduzierbarkeit der Aktivitäten scheiterten schließlich sowohl die Charakterisierung der unbekannten Proteasen als auch deren weitere Aufreinigung. Die Arbeiten sind dennoch dazu angetan, eine Vorstellung von der Größe und Komplexität des proteolytischen Systems alleine des Thylakoidlumens zu vermitteln. 2. Klonierung der Gene neuer plastidärer Proteasen und Charakterisierung der zugehörigen Genprodukte: Im Rahmen der Arbeit wurden die Gene zweier zuvor nicht beschriebener mutmaßlicher Proteasen aus Arabidopsis thaliana L. isoliert, beides Homologe zu bekannten Proteasen aus E. coli. hhoA: Das Produkt dieses Gens stellt ein Mitglied der ubiquitär verbreiteten HtrA-Familie von Serinproteasen dar, deren Zahl sich in Arabidopsis auf mittlerweile vierzehn beläuft. Es besitzt die typische katalytische Triade der Familie, läßt jedoch die zumindest für die meisten charakterisierten Homologe typische sogenannte PDZ-Domäne im N-terminalen Bereich vermissen. In den Experimenten zur Kartierung des Gens konnte gezeigt werden, daß dieses in singulärer Kopienzahl auf Chromosom IV lokalisiert ist. Anschließende Untersuchungen zur Expression konnten in Pflanzen jedoch weder unter normalen Anzuchtsbedingungen, noch nach Streßexperimenten mit Hochlicht und Hitzestreß ein spezifisches Transkript nachweisen. In vitro-Experimente belegten die Transkribier- und Translatierbarkeit des Gens; dessen Produkt im in organello-Importexperiment als lösliche Komponente im Thylakoidlumen akkumulierte. Weitere Untersuchungen an Chloroplastenfraktionen aus Spinat und Arabidopsis unter Zuhilfenahme eines gegen das heterolog exprimierte gereifte Genprodukt produzierten polyklonalen Antikörpers bewiesen, daß hhoA auch in vivo synthetisiert wird und wie im Importexperiment im Thylakoidlumen lokalisiert ist. Verschiedene Versuche zur Funktion des Proteins brachten kein eindeutiges Ergebnis. Die Transformation von Arabidopsis mit Sinnund Gegensinnkonstrukten des Gens war zwar erfolgreich, erzeugte jedoch Pflanzen ohne erkennbar vom Wildtyp abweichenden Phänotyp. sppA: Das Homolog zu der Signalpeptid-prozessierenden Protease aus E. coli, Protease IV, stellt das bislang einzige beschriebene in höheren Pflanzen dar. Das Gen ist, wie in Experimenten zu seiner Kartierung gezeigt wurde, in singulärer Kopienzahl im Genom vorhanden, lokalisiert auf Chromosom I. In Untersuchungen zur Expression konnte das Transkript unter normalen Anzuchtsbedingungen nicht nachgewiesen werden. Bei Behandeln der Pflanzen mit Lichtstreß über längere Zeit wurde jedoch ein nach mehrstündiger Latenzzeit einsetzendes Ansteigen der Transkriptrate beobachtet. Das Genprodukt wurde nach in vitro-Transkription und -Translation im in organello-Importexperiment als peripher mit der stromalen Oberfläche der Thylakoidmembran assoziiert charakterisiert. Untersuchungen an Chloroplastenfraktionen mittels Antikörpern, die gegen den C-Terminus des heterolog exprimierten SppA-Proteins produziert worden waren, bestätigten neben dem Nachweis des Vorhandenseins auch unter Normalbedingungen diese Lokalisation auch in vivo. Bei weiterer Subfraktionierung der Thylakoide fand sich das Protein vornehmlich assoziiert mit Stromathylakoiden. Die bei Bestrahlung der Pflanzen mit hohen Lichtintensitäten steigende Expressionsrate deutet auf eine funktionelle Neudefinierung von SppA in photosynthesetreibenden Organismen im Vergleich zu E. coli und auf eine Rolle innerhalb der langfristigen Adaptationsmechanismen der Pflanze gegen Lichtstreß hin. Weitere Untersuchungen konnten jedoch keine eindeutigen Hinweise bezüglich der spezifischen Funktion des Proteins liefern