Hydroxycinnamoyl-Transferasen für UV-B-Schutzpigmente in der Kiefer, Pinus sylvestris L.

Die an der Synthese von acylierten Flavonolglykosiden, den UV-B-Schutzpigmenten in der Kiefer und anderen Bäumen, beteiligten Hydroxycinnamoyl-Transferasen sind weitgehend unerforscht. Dies verwundert um so mehr, als Kenntnisse über den UV-B-Schutz bei Bäumen, die von großer ökologischer und ökonomischer Bedeutung sind, unter dem Eindruck sinkender stratosphärischer Ozonwerte und der damit prognostizierten erhöhten UV-B-Belastung auch in mittleren Breiten sehr wichtig geworden sind. Andererseits haben Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die an der Synthese von Blütenfarbstoffen (acylierte Anthocyane) und Phytoalexinen (acylierte Amine) beteiligt sind, in den letzten Jahren einige Fortschritte erbracht. In der vorliegenden Arbeit wird versucht, mit proteinbiochemischen und ökophysiologischen Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die Flavonolglykoside acylieren, hier eine Lücke zu schließen. Die Untersuchungen zu den Hydroxycinnamoyl-Transferasen lassen sich in drei Teile gliedern: (i) einen methodischen Teil, in dem mit der Entwicklung eines Enzymtests die Grundlagen für die beiden folgenden Teile erarbeitet wurden; (ii) ein physiologisch-ökologischer Teil, in dem Messungen von Enzymaktivitäten und Inhaltsstoffgehalten in Nadeln adulter Bäume im Freiland und von Keimlingen unter kontrollierten Bedingungen in Sonnensimulatoren vorgenommen wurden; (iii) ein proteinbiochemischer Teil, der eine Charakterisierung der Enyzme und die Reinigung der 3’’-HCT beinhaltet. (i) Für den Nachweis und die Quantifizierung der Aktivität der Hydroxycinnamyoltransferasen in Extrakten von Kiefernnadeln wurde ein Enzymtest entwickelt. Dafür wurde die Aufschlusstechnik und die HPLC-Methode, mit der die Enzymprodukte analysiert wurden, optimiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass in der Kiefer drei verschiedene für die Glucose der Flavonolglykoside positionsspezifische Transferasen vorhanden sind. Von den Produkten dieser Enzyme konnten die Acylierungspositionen aufgeklärt werden, wobei sich herausstellte, dass die 3’’- und der 6’’-HCT an der Synthese der UV-B-Schutzpigmente beteiligt sind, während die Produkte der 4’’-HCT in der Kiefer noch nicht bekannt sind. (ii) In Sonnensimulatorexperimenten mit Kiefernkeimlingen konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der 6’’-HCT durch UV-B induziert wurde, während die Aktivität der 3’’-HCT konstitutiv vorlag und durch UV-B nicht beeinflusst wurde. In den Freilandbäumen zeigte sich, dass die 6’’-HCT entwicklungspezifisch aktiv war, während die Aktivität der 3’’-HCT auch hier konstitutiv vorlag. Die Akkumulation der diacylierten Flavonol 3-glykoside konnte nur zu Beginn der Nadelentwicklung beobachtet werden und korrelierte mit der Aktivität der 6’’- HCT, woraus geschlossen werden kann, dass die 6’’-HCT die Synthese der UV-B-Schutzpigmente reguliert, während die Rolle der 3’’-HCT unklar bleibt, da keine Akkumulation von monoacylierten Flavonolglykosiden beobachtet wurde. Die schnelle Akkumulation und nachfolgende Abnahme der diacylierten Verbindungen zeigen, dass diese Verbindungen für den UV-B-Schutz in den besonders gefährdeten jungen Nadeln verantwortlich sind. In älteren Nadeln sind andere langfristige Schutzmechanismen vorhanden, wobei vor allem zellwandgebundene Flavonoide und Hydroxyzimtsäuren in Frage kommen, da diese langsamer akkumulieren als die löslichen diacylierten Verbindungen. Der Vergleich der Keimlingsexperimente mit den Freilanduntersuchungen zeigt, dass die Primärnadeln der Keimlinge ein gutes Modell für sich entwickelnde Nadeln von adulten Freilandbäumen darstellen, da sie sich physiologisch vergleichbar verhalten. Die Keimlinge besitzen einige Vorteile gegenüber mehrjährigen Bäumen, da sie jederzeit verfügbar und in größerer Individuenzahl untersucht werden können. (iii) Mit teilweise gereinigten Enzymen konnte gezeigt werden, dass die Acylierung der Flavonolglykoside in einer festen Reihenfolge abläuft. Die Synthese der UV-B-Schutzpigmente erfolgt durch die Acylierung zuerst an 6’’-Position und dann an 3’’-Position. Für die 3’’- und die 4’’-HCT wurde ein apparentes Molekulargewicht von 45 bzw. 35 kDa und ein pI-Wert von 4.7 ermittelt. Diese Werte liegen in einem Bereich, der ebenso für HCT’s aus verschiedenen Pflanzen, die andere Substrate acylieren, festgestellt wurde. Für die 6’’- HCT wurde dagegen ein außerordentlich geringes apparentes Molekulargewicht von 9 kDa und ein relativ hoher pI-Wert von 7.7 bis 7.9 ermittelt. Weitere Untersuchungen sind nötig, um festzustellen, ob es sich dabei um eine proteolytische Spaltung des Enzyms handelt. Alle drei Transferasen zeigten gegenüber dem Akzeptorsubstrat eine hohe Spezifität für das Flavonolaglykon, wobei die Aktivität der 6’’-HCT bei größerer Polarität an 3’-Position (Quercetin) höher war, die der 3’’-HCT bei geringerer Polarität an dieser Position (Kämpferol und Isorhamnetin). Ähnlich hoch ist auch die Spezifität gegenüber dem Zuckerrest des Akzeptorsubstrats. Die höchste Aktivität wurde mit dem Glukosid festgestellt, das bisher auch nur in der Kiefer nachgewiesen wurde. Die Spezifität gegenüber dem Donorsubstrat zeigt zum einen eine Abhängigkeit von CoAEster, da keine Aktivität mit Glukose-Estern gemessen werden konnte. Zum anderen ist der aromatische Charakter des Donorsubstrats von entscheidender Bedeutung, da sowohl die CoA-Ester verschiedener Hydroxyzimtsäuren als auch Benzoyl-CoA als Substrate verwendet werden. Aliphatische CoA-Ester wie Acetyl- oder Malonyl-CoA werden von den HCT’s nicht als Substrate akzeptiert. Mit einer analytischen Reinigung der 3’’-HCT, die säulenchromatographische Schritte beinhaltete, wurden in sechs Schritten zwei Protein-Banden mit einer Größe von 24 und 28 kDa isoliert, die mit der Enzymaktivität korrelierten. Mit einer präparativen Reinigung mit nativer Elektrophorese konnten diese beiden Banden in ausreichender Menge erhalten werden, sodass eine Sequenzierung von Peptiden möglich war. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen mit den in Datenbanken vorhandenen Sequenzen zeigte, dass es sich um zwei unbekannte Peptide handelt. Die Resultate der Reinigung bilden die Grundlage für molekularbiologische Arbeiten, mit denen es möglich sein sollte, enzymspezifische Klone für die 3’’-HCT und, falls die Enzyme auf Sequenzebene verwandt sind, auch für die 6’’-HCT herzustellen. Damit könnte zum ersten Mal die Sequenz einer Flavonol 3-glukosid-Hydroxycinnamoyl-Transferase aufgeklärt werden. Mit Hilfe von molekularen Sonden ließen sich die vermutete epidermale Lokalisierung der Enzyme überprüfen und UV-B-Induktionskinetiken auf Ebene der mRNA durchführen. Dabei wären vor allem Experimente mit UV-B-Intensitäten sinnvoll, mit denen die obere Grenze der Anpassungsfähigkeit der Kiefer definiert werden kann