Diversidad de levaduras no-Saccharomyces en diferentes ecosistemas vitivinícolas

El proceso de vinificación incluye numerosas reacciones bioquímicas y procesos, en los que participan distintas especies de levaduras, como la especie S. cerevisiae o el grupo conocido con el nombre de no-Saccharomyces. Las levaduras de este grupo pueden favorecer el perfil organoléptico del vino, sobre todo durante la fermentación, pero también colonizar y alterar negativamente los vinos ya terminados durante su estancia en la bodega o después del embotellado. Todas estas levaduras proceden de la superficie de las uvas o del contacto de uvas, mostos o vinos con el equipamiento y las instalaciones de las bodegas, colonizados por levaduras procedentes de vendimias anteriores o de materiales auxiliares y la diseminación de las mismas en la bodega tiene lugar a través de la maquinaria, de los trabajadores y a través del aire. El conocimiento de las levaduras presentes en los distintos ambientes enológicos es necesario para avanzar en la utilización de especies y cepas que mejoren la calidad del vino obtenido y, también, valorar los riesgos de alteración que puedan suponer. El objetivo general de este trabajo fue hacer una aproximación a la ecología de las levaduras no-Saccharomyces en el contexto de la D.O.Ca. Rioja. Para ello se llevaron a cabo diferentes ensayos: dos en uvas, dos en fermentación alcohólica, uno en superficies y en mosto en contacto con las mismas y dos en aire de bodegas. En ellos, se estudió la población de levaduras presente en cada uno de los medios, identificando las especies de levaduras en las uvas de tres parcelas durante el periodo de maduración, las fermentaciones alcohólicas correspondientes a esas parcelas, los equipos y superficies de cuatro bodegas y el mosto en contacto con las mismas y el aire de las principales zonas de tres bodegas. Además, se estudió la capacidad de algunos medios de cultivo para la recuperación de levaduras desde el aire. Se utilizaron las técnicas de PCR-RFLP, de la región ITS del ADN ribosómico, la secuenciación del dominio D1/D2 de su genoma y la técnica de PCR anidada específica para la especie B. bruxellensis. Los recuentos de levaduras en las uvas al final del periodo de maduración fueron siempre del orden de 103-104 UFC/baya y la diversidad específica aumentó con la maduración de las uvas. Las poblaciones no siguieron siempre la misma evolución, pues en el primer ensayo aumentaron con la maduración, pero en el segundo disminuyeron. Se detectaron siete especies de levaduras diferentes (Cryptococcus magnus, M. pulcherrima, K. apiculata, C. stellata, A. pullulans, Rhodotorula glutinis y Candida stellimalicola) en todas las muestras de uva estudiadas y, de ellas, las especies mayoritarias fueron Kloeckera apiculata, Cryptococcus magnus y Aureobasidium pullulans. La diversidad de levaduras en los mostos en fermentación fue considerable. Se encontraron 17 especies distintas en el conjunto de las elaboraciones estudiadas. Las especies, Candida stellata y Kloeckera apiculata fueron detectadas en todas las elaboraciones de manera continua y en proporciones elevadas hasta las 72 horas de la fermentación alcohólica, suponiendo hasta ese momento el 80% de la población. Se identificaron otras especies en sucesivos muestreos, pero solo en una de las elaboraciones: Pichia sp en Rioja Alta, M. pulcherrima y Zygosaccharomyces veronae en Rioja Media e I. orientalis y Z. bailii en Rioja Baja, lo que podría deberse a la diferente carga microbiana de cada uva o a las características de cada mosto. En todos los casos, en el muestreo de fin de fermentación solo se detectó S. cerevisiae. La presencia de Saccharomyces cerevisiae en el mosto, su mejor adaptación y mejor competencia por los recursos del medio, condicionaron la supervivencia de las especies no-Saccharomyces a lo largo de la fermentación alcohólica. Cuando esta especie fue detectada desde el comienzo del encubado, las levaduras no-Saccharomyces no fueron encontradas más allá de las 48 horas. Se detectó mayor diversidad de levaduras en los mostos en fermentación que en las uvas, lo que podría sugerir el aporte de otras especies procedentes de la maquinaria y equipos de las bodegas. El equipamiento y las instalaciones de las bodegas albergaron una importante población de levaduras no-Saccharomyces, muy superior a la de la especie Saccharomyces cerevisiae. Se identificaron 18 especies dentro de ese grupo, algunas con cierta capacidad fermentativa, capaces de colonizar los mostos y participar de forma activa en la fermentación alcohólica o de alterar los vinos. Los métodos de limpieza del equipamiento y las instalaciones de las bodegas influyeron en las poblaciones de levaduras presentes, consiguiendo con la aplicación de una disolución de metabisulfito potásico una mayor eliminación de la micobiota residente en las superficies que con la utilización de productos a base de hidróxido de sodio y posterior aclarado con agua. Las poblaciones de levaduras encontradas en el aire de las bodegas fueron muy bajas, inferiores a 20 NMP/m3, a lo largo del año y en las distintas zonas de las bodegas, sin verse afectadas por factores como temperatura, humedad relativa o edad de la bodega. El aumento en la actividad llevada a cabo en cada una de las zonas de las bodegas fue el factor determinante en la variación del tamaño de las poblaciones de levaduras detectadas en el aire, así como en la distribución de especies. En las zonas de elaboración durante la época de vinificación aumentaron las poblaciones y la especie dominante fue Saccharomyces cerevisiae, aunque anteriormente no hubiera sido detectada en el aire de ninguna de las zonas de las bodegas. Las levaduras detectadas en el aire de las bodegas pertenecían mayoritariamente al grupo de los Basidiomicetos y Ascomicetos esporulados, que no son consideradas como alterantes de los vinos. Los géneros presentes en las bodegas estudiadas de una manera continua fueron Cryptococcus y Aureobasidium, del total de 12 géneros identificados. La detección en el aire de Brettanomyces bruxellensis mientras se manipulaban vinos contaminados con esa levadura o la identificación de Saccharomyces cerevisiae durante la fermentación alcohólica en el aire de la nave de elaboración y en la de embotellado, adyacente a la primera, demostraron que el aire es un medio de diseminación de microorganismos desde mostos o vinos que están siendo manipulados al ambiente. La detección de levaduras presentes en el aire de las bodegas puede realizarse con distintos medios de cultivo. El medio CGA permitió la recuperación de un mayor número de levaduras mientras que el medio AL permitió la detección de una mayor diversidad. Por su parte, el medio DBDM fue el único que permitió el aislamiento de la especie Brettanomyces bruxellensis en el aire. Los géneros detectados de forma continua en todos los ecosistemas estudiados fueron Cryptococcus y Aureobasidium, con la excepción de las fermentaciones alcohólicas, puesto que son géneros que carecen de capacidad fermentadora. Las especies no-Saccharomyces que participaron de manera más importante en las fermentaciones, Candida stellata y Kloeckera apiculata, no tuvieron una presencia relevante ni continua en las instalaciones ni en el aire de las bodegas