Detección y caracterización de Brettanomyces bruxellensis y Trigonopsis cantarellii en el contexto enológico

Brettanomyces/Dekkera es la principal causa de las alteraciones microbiológicas que actualmente pueden sufrir los vinos, y especialmente los vinos tintos de calidad que deben ser sometidos al proceso de crianza en barricas de madera. Esta levadura es responsable de cuantiosas pérdidas económicas de la industria enológica en todos los países productores del mundo. El primer objetivo de esta tesis fue poner a punto el método rápido de PCR cuantitativa (qPCR) para la detección y cuantificación de células de Brettanomyces/Dekkera en muestras vinos tintos tomadas en distintos momentos de su elaboración y conservación, así como de otras muestras de bodega que tuvieran interés para el enólogo. El primer hito alcanzado en el trabajo fue eliminar la grave interferencia que suponen las partículas sólidas de agregados macromoleculares y compuestos polilfenólicos presentes en un vino no acabado y que son responsables de la inhibición de la reacción de la DNA polimerasa. Conseguida la puesta a punto del método de qPCR, se realizó el estudio comparativo con el método clásico de cultivo microbiológico en un medio selectivo, empleándose para ello un total de 324 muestras de vinos tintos de la variedad Tempranillo provenientes de las denominaciones de origen Rioja y Ribera del Duero, recogidas en el periodo 2009 - 2011. El estudio estadístico comparativo presentó una buena correlación entre los resultados obtenidos por los dos métodos, poniéndose de manifiesto la mayor especificidad del método rápido de qPCR, en el que no se encontraron resultados falsos positivos y se alcanzó el límite de detección y cuantificación entre 16 - 25 células de Brettanomyces/mL en vinos tintos con turbidez y en presencia de hasta 7,5 105 UFC/mL de levaduras de otras especies. El método clásico de cultivo microbiológico en medio selectivo permitió detectar y cuantificar hasta 1 UFC/mL de células viables de Brettanomyces/Dekkera en los vinos y además permitió la detección de Brettanomyces/Dekkera en el aire de bodega. El siguiente objetivo fue estudiar la sensibilidad de Brettanomyces/Dekkera a distintos agentes antimicrobianos de uso en enología para determinar el método más eficaz de combatir esta levadura alterante. Los agentes antimicrobianos que se estudiaron fueron: metabisulfito potásico (MBP), solución de taninos enológicos, chitosan y dicarbonato de dimetilo (DMDC). Dentro de los respectivos rangos de concentraciones de uso permitido en enología, el agente que presentó la mayor especificidad para Brettanomyces/Dekkera fue el chitosan, y el agente que mostró la mayor eficacia fue el MBP, presentando actividad inhibidora del crecimiento y también biocida frente a la totalidad de las cepas estudiadas (CMI90 y CMB90= 48 mg/L, en presencia de 12,5 % etanol en el medio). Este agente se empleó posteriormente para el estudio en vino tinto contaminado de forma natural por Brettanomyces/Dekkera y conservado en botella en condiciones de bodega. Se pudo demostar una correlación directa entre la población de células de Brettanomyces/Dekkera (UFC/mL) y el aumento de la concentración de los fenoles volátiles (4-etilguaiacol, 4-etilfenol, 4-vinilfenol y 4-propilguaiacol) en el vino, quedando totalmente excluida la posibilidad de que bacterias lácticas u otros microorganismos fueran los responsables de la producción de estos compuestos. Una concentración de 100 mg/L de MBP se mostró plenamente eficaz y evitó el crecimiento de Brettanomyces/Dekkera y por tanto también el aumento de los fenoles volátiles en los vinos estudiados. En esta tesis además se identificaron las siguientes especies de levaduras del orden Saccharomycetales presentes en muestras de vinos en proceso de crianza en barricas de madera, recogidas en el periodo 2008 - 2011 y sospechosas de contaminación por análisis sensorial con indicios de cierta desviación aromática: Pichia mandshurica, Pichia holstii, Trigonopsis cantarelli, Trigonopsis variabilis y Arthroascus schoenii. La especie más recurrente resultó ser T. cantarellii, representando el 54,5 % de los aislados estudiados. Se caracterizó esta levadura, comprobándose su capacidad de crecer en vinos tintos secos (< 0,2 g/L de azúcares reductores) con un alto contenido en etanol (hasta 13,8 %) y su mayor resistencia al MBP que la de Brettanomyces/Dekkera. Las levaduras de la especie T. cantarelli mostraron un crecimiento lento, y la capacidad potencialmente alterante de generar ácidos se demostró en un 48 % de las cepas estudiadas, así como el potencial de generar aromas alterantes en un 72 % de las cepas, si bien con un potencial alterante aromático menor que el detectado habitualmente en Brettanomyces/Dekkera.Brettanomyces/Dekkera is currently the leading cause of microbiological alterations in wines, especially those premium red wines that undergo aging processes in wooden barrels. This yeast is responsible for huge economic losses in the winemaking industry in all producing countries of the world. The first objective of this thesis was to develop a rapid method of quantitative PCR (qPCR) for detection and quantification of Brettanomyces/Dekkera cells in red wine samples taken at different stages of production and conservation, as well as in samples of interest to the winemaker. The first milestone achieved in this work was to eliminate the serious interferences involving macromolecular aggregates of solid particles and polyphenolic compounds present in non-finished wines that are responsible for inhibition of DNA polymerase reactions. Once optimization of the qPCR method was achieved, a comparative study was carried out with the method of classical microbiological culture in selective medium, using a total of 324 Tempranillo red wines from both Rioja and Ribera del Duero appellations, and collected during the period 2009 - 2011. Statistical comparisons showed a good correlation between the results of both methods, emphasizing the greater specificity of qPCR, for which no false-positive results were found and that the detection and quantification limits were between 16 - 25 Brettanomyces cells/mL in those red wines with turbidity and in the presence of up to 7.5 105 CFU/mL of other yeast populations. The method of microbiological culture in selective medium allowed detection and quantification of down to 1 Brettanomyces/Dekkera CFU/mL in wines, and also in cellar air. The next goal was to study the sensitivity of Brettanomyces/Dekkera to different antimicrobial agents used in winemaking and to determine the most effective method against this spoiling yeast. The antimicrobial agents studied were: potassium metabisulphite, enological tannins solution, chitosan and dimethyl dicarbonate. Within the respective ranges of concentrations permitted in enology, the agent that showed the highest specificity against Brettanomyces/Dekkera was chitosan, and the agent that showed the greatest efficacy was potassium metabisulphite, showing growth inhibitory activity and biocide effect against all the strains tested (MIC90 and MBC90 = 48 mg/L, in the presence of 12.5 % ethanol in the medium). This agent was used subsequently to study Brettanomyces/Dekkera naturally contaminated red wines stored in bottles and kept under cellar conditions. A direct correlation was demonstrated between the Brettanomyces/Dekkera populations (CFU/mL) and the increase of concentrations of volatile phenols (4-ethylguaiacol, 4- ethylphenol, 4-vinylphenol and 4-propylguaiacol) in wines, being completely excluded the possibility of lactic acid bacteria or other microorganisms responsible for the production of these compounds. A concentration of 100 mg/L MBP was fully effective and prevented both the growth of Brettanomyces/Dekkera, and the consequent increase of volatile phenols in the studied wines. In this thesis the following species of Saccharomycetales yeasts were also identified in samples of wines undergoing aging in wooden barrels collected in the period 2008 - 2011 and suspected of being contaminated under sensory analysis once they presented some evidence of aromatic deviation: Pichia mandshurica, Pichia holstii, Arthroascus schoenii, Trigonopsis variabilis, and Trigonopsis cantarelli. The most recurrent species was T. cantarellii, and represented 54.5 % of all studied isolates. This yeast species was characterized and proved its ability to grow in dry red wines (< 0.2 g/L reducing sugars) with a high ethanol content (up 13.8 %) and greater resistance to potassium metabisulphite than Brettanomyces/Dekkera. T. cantarellii yeasts showed very slow growth, and the ability to generate potentially spoiling acids was demonstrated in 48 % of the studied strains, and likewise, the potential to generate some deviation aromas was found on 72 % of strains, although with a lower potential than those usually found for Brettanomyces/Dekkera