Analysis of TIM2 deficiency in the mouse retina

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, na especialidade de Ciências Biológicas e BiomédicasCareful control of iron availability in the retina is central to maintenance of iron homeostasis, as its imbalance is associated with oxidative stress and progress of several retinopathies, such as diabetic retinopathy. Ferritin, known for its role in iron storage and detoxification, has also been proposed as an iron-transporter and can be regarded as a potential deliverer of a considerable large amount of iron to the retina compared to transferrin, the classical ironcarrier protein. Ferritin can bind to scavenger receptor class A member 5 (Scara5) and T-cell immunoglobulin and mucin-domain 2 (TIM2) receptors and is likely endocytosed. In this study, the presence of TIM2, which remained unknown in the retina, was investigated. Although no human ortholog for mouse TIM2 has been identified, human TIM1 and mouse TIM2 have similar functions. Our results revealed for the first time the presence of TIM2 receptors in the mouse retina, mainly expressed in Müller cells, unveiling new aspects of retinal iron metabolism regarding the putative role of TIM2 in this tissue. A knockout mouse for this membrane receptor was generated in order to better understand TIM2 functions in the retina. TIM2 deficiency affected retinal iron metabolism. Iron-loaded ferritin accumulation, probably due to increased ferritin uptake mediated by Scara5, and increased iron uptake by transferrin receptor 1 (TfR1)- transferrin binding led to retinal iron overload. Consequently, increased vascular permeability and blood-retinal barrier (BRB) breakdown were observed, inducing edema of the central retina. Paracellular and transcellular transports were impaired with tight junction integrity loss and increased caveolae number. Two mechanisms seem to be involved in this process: association of iron and ferritin overload with vascular endothelial growth factor (VEGF) overexpression and oxidative stress triggered by reactive oxygen species (ROS) overproduction generated by retinal iron overload. Altogether, these results point to TIM2 as a new key player in iron homeostasis in the mouse retina, possibly modulating cellular iron levels, and a potential target for the treatment of diabetic macular edema.RESUMO - Análise da deficiência de TIM2 na retina de murganho - A retina necessita especificamente de ferro, devido a este ser um co-factor essencial da enzima guanilato ciclase que assegura a síntese de monofosfato de guanosina cíclico, segundo mensageiro na cascata de fototransdução. Para além disso, a retina é particularmente dependente de ferro devido à contínua necessidade de síntese de membranas, para suprir a constante renovação dos segmentos externos dos fotorrecetores, que requer como co-factor este elemento. Porém, o desequilíbrio da homeostasia do ferro está associado ao dano oxidativo e ao desenvolvimento de várias situações de retinopatia, como por exemplo a retinopatia diabética. A retina é particularmente propensa a stress oxidativo e o excesso de ferro exacerba potencialmente esta situação, devido à participação do ferro na reação de Fenton, que gera a superprodução de espécies reativas de oxigénio que, por sua vez, desencadeiam stress oxidativo. Por conseguinte, a manutenção da homeostasia do ferro é crucial neste tecido. Contudo, mecanismos de regulação do ferro na retina ainda não são completamente conhecidos. A retina obtém ferro a partir da circulação sanguínea. No entanto, a barreira hemato-retiana isola a retina da circulação sanguínea, protegendo-a de potenciais estímulos nocivos. Assim, são necessários mecanismos específicos e rigorosamente regulados de absorção de ferro para atravessar esta barreira e importar a quantidade de ferro estritamente essencial para o normal funcionamento da retina. Classicamente, a transferrina foi estabelecida como a proteína transportadora de ferro na retina, sendo aceite que a transferrina sérica se liga ao seu recetor de membrana, recetor da transferrina 1, na superfície das células endoteliais e do epitélio pigmentar da retina. Após a endocitose deste complexo, o ferro é libertado no parênquima retiniano. Mais recentemente, a ferritina, considerada classicamente como uma proteína de armazenamento de ferro e destoxificação, foi também proposta como uma proteína transportadora deste elemento. A vantagem da ferritina sérica em relação à transferrina no transporte de ferro prende-se na capacidade da ferritina de incorporar ~ 4,500 átomos de ferro, ao passo que a transferrina apenas transporta 2 átomos de ferro, constituindo, assim, a ferritina uma fonte muito eficiente de ferro para os tecidos. A molécula da ferritina é composta por 24 subunidades de dois tipos: cadeia leve (L) e cadeia pesada (H) que se unem aos recetores Scara5 (scavenger receptor class A member 5) e TIM2 (T-cell immunoglobulin and mucin-domain 2), respetivamente. O nosso grupo identificou pela primeira vez a presença de recetores Scara5 na retina humana e do murganho. No entanto, até à data, a presença de recetores TIM2 na retina não foi reportada na bibliografia. O TIM2, uma proteína transmembranar do tipo 1, é um membro da família de genes portadores dos domínios mucina e imunoglobulina de células T e, para além de ser um recetor para a ferritina-H, está envolvido na regulação da resposta imunitária...N/