Novel insight into the mechanism of cellulosome assembly and plant cell wall hydrolysis in anaerobic bacteria

Tese de Doutoramento em Ciência e Tecnologia AnimalCellulosomes are one of nature’s most elaborate and highly efficient nanomachines. These cell bound multi-enzyme complexes orchestrate the deconstruction of cellulose and hemicellulose, two of the most abundant polymers on earth, thus playing a major role in carbon turnover. Integration of cellulosomal components occurs via highly ordered protein:protein interactions between cohesins and dockerins, whose specificities allow the precise incorporation of cellulases and hemicellulases onto a molecular scaffold. Clostridium thermocellum and C. cellulolyticum cellulosomes have been extensively characterized and constitute the paradigm for the organization of cellulases and hemicellulases in multi-enzyme complexes by thermophilic and mesophilic anaerobic bacteria, respectively. The recent sequencing of C. thermocellum and C. cellulolyticum genomes allowed the identification of the complete set of cohesins, dockerins and cellulosomal domains encoded by these bacteria. Here, several unresolved issues concerning cohesin-dockerin specificity, cellulosome assembly and the role of cellulosomal catalytic components in plant cell wall hydrolysis will be explored. The ligand specificities of some newly identified C. thermocellum cohesin and dockerin domains were described (Chapter 2). A novel cell-bound protein, termed OlpC, which contains a type I cohesin domain was discovered in C. thermocellum. A restricted set of dockerins were shown to interact, primarily, with OlpC. All the remaining dockerin containing polypeptides expressed by C. thermocellum are directed to cellulosomes. Significantly, the structure of two C. cellulolyticum cohesin-dockerin complexes revealed that, as it was previously reported for C. thermocellum, mesophilic dockerins also express a dual binding mode for cohesins (Chapter 3). Initial crystallization studies with the two N-terminal domains of C. thermocellum cellulosomal xylanase Xyn10B anticipate the elucidation of its 3D structure, which may provide insightful data concerning the function of this enzyme in plant cell wall hydrolysis (Chapter 4). Finally, a cellulosomal family 2 CE (CtCE2), which grafts a second discrete non-catalytic binding functionality into its active site, was characterized (Chapter 5). CtCE2 provides a rare example of “gene sharing” where the introduction of a second functionality into the active site of an enzyme does not compromise the original activity of the biocatalyst.RESUMO - Nova perspectiva no mecanismo de integração do celulossoma e na degradação da parede celular vegetal por bactérias anaeróbias - Os celulossomas são um dos mais intricados e eficientes complexos multi-enzimáticos existentes na Natureza. Estes complexos, que se encontram ligados à parede celular bacteriana, desempenham um papel importante na degradação da celulose e da hemicelulose, dois dos mais abundantes polímeros na terra. A integração dos componentes celulossomais ocorre através de interacções proteína-proteína, muito ordenadas, estabelecidas entre coesinas e doquerinas, cuja especificidade permite a incorporação precisa de celulases e hemicelulases numa proteína de integração celulossomal. Os celulossomas dos organismos Clostridium thermocellum e C. cellulolyticum têm sido extensivamente caracterizados e constituem o paradigma para a organização de celulases e hemicelulases em complexos multienzimáticos de bactérias anaeróbias, tanto termófilas como mesófilas, respectivamente. A recente sequenciação dos genomas do C. thermocellum e do C. cellulolyticum permitiu a identificação de um conjunto completo de coesinas, doquerinas e domínios celulossomais codificados por estas bactérias. Neste trabalho, várias questões relativas à especificidade coesina-doquerina, à formação do celulossoma e ao papel dos componentes celulossomais catalíticos serão investigadas. A especificidade de doquerinas e coesinas do C. thermocellum recentemente identificados foi descrita (Capítulo 2). Uma nova proteína da parede celular, designada como OlpC, que contém um domínio doquerina, foi descoberta no C. thermocellum. Demonstrou-se que um conjunto restrito de doquerinas reage preferencialmente com a OlpC. Os restantes polipéptidos expressos pela bactéria C. thermocellum, contendo também doquerinas, ligam-se ao celulossoma. A estrutura de dois complexos coesina-doquerina do C. cellulolyticum revelou, como previamente comunicado para a bactéria C.thermocellum, que as doquerinas de organismos mesófilos também apresentam uma dupla ligação para com as coesinas (Capítulo 3). Estudos preliminares de cristalização dos dois domínios Nterminais da xilanase celulossomal Xyn10B antecipam a futura elucidação da sua estrutura 3D, o que poderá esclarecer a função deste enzima na hidrólise da parede celular vegetal (Capítulo 4). Finalmente, foi descrita uma esterase de hidratos de carbono da família 2 (CtCE2), que apresenta uma funcionalidade discreta, não-catalítica de ligação a glúcidos no seu centro catalítico. A CtCE2 fornece um raro exemplo de “gene sharing”, onde a introdução de uma segunda funcionalidade no centro catalítico de uma enzima não compromete a actividade original do biocatalisador.This work was funded by Fundação para a Ciência e a Tecnologia, grant SFRH/BD/25439/2005 Co-funded by POCTI/BIA-PRO/59118/2004 and PPCDT/BIA-PRO/59118/2004 from Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superio