Wide-Field Fluorescence Hyperspectral Imaging to Quantify Cell Populations in Spheroids Formed and Cultured in Microfluidic Chips

RÉSUMÉ: Le cancer de l'ovaire a le taux de mortalité le plus élevé de tous les cancers gynécologiques. Malgré les avancements en techniques de chirurgie et les développements en chimiothérapie au cours de la dernière décennie, son taux de survie après cinq ans demeure inférieur à 45%, en raison du diagnostic tardif de ce cancer et du phénomène de résistance aux médicaments. Les patients présentant un cancer épithélial de l'ovaire (CÉO), la forme la plus courante de la maladie, répondent généralement bien au traitement de chimiothérapie standard à base de platine et de taxane. Cependant, une forte proportion de patients rechute et cette récurrence se révèle souvent résistante au traitement standard. Une des hypothèses de cette résistance chez le CÉO est que son instabilité génétique élevée se traduit par une hétérogénéité clonale dans les tumeurs, où le nombre de clones (populations de cellules identiques) dans les tumeurs augmente avec le temps, créant de nouvelles mutations présentant différents niveaux de sensibilité aux traitements. Par exemple, le premier traitement de chimiothérapie d'une patiente peut tuer les clones sensibles et laisser une faible population de cellules résistantes qui finiront par croître et provoquer une rechute du cancer. Il est donc nécessaire d'étudier l'hétérogénéité clonale et ses effets sur la résistance aux médicaments. Divers modèles de cancer in vitro ont été développés pour la recherche en laboratoire. Le modèle le plus simple et le plus courant est la culture en monocouches bi-dimensionnelles (2D), pour laquelle les cellules cancéreuses adhèrent à une surface, comme les boîtes de pétri, et croissent en monocouche. Le modèle le plus réaliste consiste à utiliser directement les tumeurs de patients, car elles incluent le microenvironnement complet du cancer en trois dimensions (3D). Cependant, comme le tissu du patient est souvent disponible en quantités limitées, le nombre d'expériences qu'il est possible de faire est aussi limité. Les sphéroïdes sont des agrégats de cellules 3D formés in vitro et représentent un compromis idéal entre la simplicité, leur composition cellulaire étant connue et contrôlée, et le réalisme, car ils imitent mieux la nature 3D des tumeurs humaines que la culture en monocouches 2D. Les sphéroïdes peuvent facilement être utilisés pour étudier l'hétérogénéité clonale car plusieurs lignées cellulaires peuvent être mélangées à des ratios précis pour former des sphéroïdes de coculture. La communauté microfluidique a mis au point des puces microfluidiques qui peuvent facilement former et traiter des centaines de sphéroïdes. Dans ce projet, les puces microfluidiques sont utilisées pour réduire le travail en laboratoire en formant des dizaines de sphéroïdes en une seule étape et en les piégeant en place, de sorte que les changements de milieu de culture et de médicaments peuvent être rapidement effectués. L'un des principaux avantages de l'utilisation de sphéroïdes comme modèle de cancer in vitro est que des centaines de sphéroïdes de coculture identiques peuvent être utilisés pour étudier facilement diverses conditions. Cependant, l'analyse de la réponse dynamique de chacune des populations de cellules composant ce grand nombre de sphéroïdes reste un défi. Les études utilisent souvent la morphologie cellulaire, les marqueurs immunologiques ou les marqueurs fluorescents pour identifier les populations cellulaires. Mais beaucoup de ces techniques reposent sur l'observation directe de chaque cellule composant le sphéroïde et nécessitent soit une digestion du sphéroïde en une suspension cellulaire, soit une coupe du sphéroïde en fines tranches. Pour analyser des échantillons 3D intacts, des techniques de microscopie telles que la microscopie confocale, multiphotonique et à feuilles de lumière (light sheet microscopy) ont été développées. Bien qu'elles présentent de nombreux avantages, ces techniques ne sont pas adaptées pour analyser un haut nombre de sphéroïdes en une seule acquisition ou ne peuvent pas analyser les sphéroïdes de diamètres supérieurs à 70-100 µm. Au cours de ce doctorat, un système d'imagerie hyperspectrale (HSI) en fluorescence à large champ a été conçu, construit et validé pour l'étude de sphéroïdes en coculture. Le système HSI a été spécifiquement conçu pour imager plusieurs sphéroïdes en une seule acquisition et pour l'imagerie in situ de sphéroïdes dans des puces microfluidiques. La conception du système HSI, présentée dans l'article 1, repose sur l'utilisation d'un filtre accordable à cristaux liquides et d'une caméra à dispositif à transfert de charges à multiplication d'électrons (EMCCD) pour l'imagerie des sphéroïdes dans un champ de vision de 7,25 mm de diamètre. Un algorithme d'analyse d'image a également été développé pour compenser toute réponse du système influençant l'intensité de fluorescence mesurée pour chaque sphéroïde présent dans l'image. Une étape finale de quantification pour compenser les propriétés optiques de l'échantillon a également été développée et validée à l'aide de fantômes optiques. L'article 2 présente une méthodologie pour étudier l'hétérogénéité clonale et sa relation avec la réponse au traitement. Deux lignées cellulaires fluorescentes ont été dérivées de la même lignée cellulaire du cancer de l'ovaire et ont été utilisées pour former des sphéroïdes de coculture avec différents ratios d'ensemencement cellulaire initiaux. Les résultats montrent que le système HSI permet de suivre la croissance de chaque population cellulaire et sa réponse aux médicaments en fonction du temps, y compris pour les populations occupant seulement 10% des sphéroïdes. L'accaparement d'un clone par rapport à l'autre dans les sphéroïdes a également été observé lorsqu'une forte dose de chimiothérapie était utilisée pour traiter les sphéroïdes. Le système HSI a également pu mettre en évidence différentes dynamiques de réponse au médicament entre les deux populations de cellules. L'imagerie hyperspectrale en fluorescence à champ large est une technique idéale pour l'imagerie de plusieurs sphéroïdes en une seule acquisition. Sa résolution spectrale permet de quantifier un plus grand nombre de fluorophores que les cubes de filtres de microscopie standards. L'imagerie hyperspectrale pourrait également être utilisée pour étudier les sphéroïdes de coculture constitués de différents types de cellules, tels que les cellules épithéliales et stromales ou les cellules cancéreuses et immunitaires. ABSTRACT: Ovarian cancer has the highest mortality rate of all gynecological cancers. Despite advancement in surgery and chemotherapy over the past decade, its five-year survival rate is still less than 45%, due to late diagnosis and drug resistance. Patients presenting epithelial ovarian cancer (EOC), the most common form of the disease, usually respond well to the standard platinum- and taxane-based chemotherapy treatment. However, a high proportion of patient relapses, and this recurring cancer is often found to be resistant to the standard treatment. One hypothesis for this drug resistance in EOC is that its known high genetic instability translates into clonal heterogeneity in tumours, where the number of clones (i.e. populations of identical cells) in tumours increases over time as new mutations create new clones of various drug sensitivity levels. A patient's first chemotherapy treatment can kill the sensitive clones and leave a small population of resistant cells that will eventually grow and cause a cancer relapse. There is a need to study clonal heterogeneity and its effect on drug resistance. Various in vitro cancer models were developed to research cancer treatments. The simplest and more common model is the 2D monolayer culture, where cancer cells adhere to a surface, such as petri dishes, and grow in a monolayer. The most realistic model involves using actual patient tumours, as they include the complete cancer microenvironment in three dimensions (3D). However, limited patient tissue is usually available to perform large experiment repetitions. Spheroids are 3D cell aggregated formed in vitro and represent an ideal compromise between simplicity, as the cell composition is known and controlled, and realism, as they better mimic the 3D nature of human tumours compared to monolayer 2D culture. Spheroids can easily be used to study clonal heterogeneity as multiple cell lines can be mixed at specific ratios to form co-culture spheroids. The microfluidic community has developed microfluidic chips that can easily form and treat hundreds of spheroids. Here, microfluidic chips are used to reduce laboratory work by forming 120 spheroids in a single step and trap the spheroids in place so that medium and drug changes can be quickly done. One of the main advantages of using spheroid as an in vitro cancer model is that hundreds of identical co-culture spheroids can be made to easily study various conditions. However, analyzing the dynamic response of individual cell populations of this large number of spheroids is still a ix challenge. Researchers often use cell morphology, immunostains or fluorescent markers to identify cell populations. But many of these techniques rely on the direct observation of each cell in the spheroid and require either spheroid digestion into a single cell suspension or spheroid slicing into thin tissue slices. To analyze intact 3D samples, microscopy techniques such as confocal, multiphoton, and light sheet microscopy were developed. While they present many advantages, these techniques are either not adapted to analyze many spheroids in a single acquisition or cannot analyze up to the centre spheroids larger than 70-100 μm in diameter. In this dissertation, a wide-field fluorescence hyperspectral imaging (HSI) system was designed, build and validated for co-culture spheroid research. The HSI system was specifically designed to image multiple spheroids in a single acquisition and for in situ imaging of spheroids in microfluidic chips. The HSI system design, presented in Article 1, is based on the use of a liquid crystal tunable filter and an electron-multiplying charged-coupled device camera to image spheroids in a 7.25 mmin diameter field of view. An image analysis algorithm was also developed to compensate for any system response influencing the measured fluorescence intensity from each spheroid present in the image. A final quantification step to compensate for the optical properties of the sample was also developed and validated using optical phantoms. Article 2 presents a methodology to study clonal heterogeneity and its relation to treatment response. Two fluorescent cell lines were derived from the same ovarian cancer cell line and used to form co-culture spheroids with various initial cell seeding ratios. Results show that the HSI system was able to follow each cell population growth and response to drugs over time, including for populations occupying only 10% of the spheroid. The onset of a clonal takeover was also observed when a high dose of chemotherapy drug was used to treat the spheroids. The HSI system was also able to highlight different response rates to the drug between the two cell populations. Wide-field fluorescence hyperspectral imaging is an ideal technique to images multiple spheroids in a single acquisition. Its spectral resolution can quantify a larger number of fluorophores than standard microscopy filter sets. Hyperspectral imaging could also be used to study co-culture spheroids made of different cell types, such as epithelial and stromal cells, or cancer and immune cells