Σύγκριση του χαρακτηρισμού της εξωκυττάριας ουσίας των μεσεγχυματικών κυττάρων απο τον ανθρώπινο μυελό των οστών που έχουν διαφοποποιηθεί προς οστεοκύτταρα και καλλιεργηθεί σε πολυστυρένιο και σε βιουλικό χιτοζάνης-ζελατίνης

Στην παρούσα μελέτη στοχεύουμε στην επέκταση των προηγούμενων παρατηρήσεών μας σχετικά με την ικανότητα στήριξης του ικριώματος που αποτελείται από 40%/60% χιτοζάνη / ζελατίνη (CS / Gel) στη διαφοροποίηση προς οστεοκύτταρα, αξιολογώντας τη σύνθεση της εξωκυττάριας μήτρας (ECM) που παράγεται από μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα ανθρώπινου μυελού των οστών (BM-MSCs) που υφίστανται διαφοροποίηση προς οστεοκύτταρα σε αυτό το ικρίωμα. Τα BM-MSC χαρακτηρίστηκαν με βάση τα μορφολογικά / ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηριστικά τους και το δυναμικό διαφοροποίησης προς οστεοκύτταρα και λιποκύτταρα. Τα ΒΜ-MSCs καλλιεργήθηκαν στο ικρίωμα και στο πολυστυρένιο(TCPS) που ήταν το control και αξιολογήθηκε η διαφοροποίηση προς οστεοκύτταρα. Η ικανότητα διαφοροποίησης προς οστεοκύτταρα στο ικρίωμα αποδείχθηκε από την έκφραση mRNA των γονιδίων που σχετίζονται με την οστεογέννεση RUNX2, ALP, OSC, DLX5. Αξιοσημείωτα, η έκφραση του mRNA της ALP και OSC ήταν υψηλότερη στα ικριώματα σε σύγκριση με τα TCPS. Το PCR Array χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η έκφραση του mRNA των 29 γονιδίων που σχετίζονται με ECM οστών. Παρουσιάζουμε, για πρώτη φορά, τη διαφορετική έκφραση των γονιδίων 28/29 εντός του ικριώματος CS / Gel σε σύγκριση με τα TCPS. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τα κολλαγόνα τύπου Ι Α1 και τύπου V Α1, τους αναστολείς πρωτεασών ECM,τις πρωτεάσες της ECM και την οστεοποντίνη, μεταξύ άλλων, μειώθηκαν σημαντικά στο ικρίωμα , ενώ γονίδια που κωδικοποιούν μεταλλοπρωτεάσες της ECM και τη βιτρονεκτίνη ρυθμίστηκαν προς τα πάνω. Τα δεδομένα ανοσοφθορισμού για την ανίχνευση της έκφρασης των πρωτεϊνών ,δηλαδή του κολλαγόνου τύπου Ι Α1,της οστεοποντίνης, που σχετίζονται με την ECM οστού ευθυγραμμίζονταν με τα αποτελέσματα της συστοιχίας PCR. Συμπερασματικά, παρέχουμε ένα περιεκτικό χαρακτηρισμό ECM οστού σε καλλιέργειες ανθρώπινων BM-MSCs που διαφοροποιούνται προς οστεοκύτταρα σε σκελετούς CS / Gel. Τα ευρήματά μας αναμένεται να συμβάλλουν στην καλύτερη κατανόηση των πολύπλοκων αλληλεπιδράσεων κυττάρου-ικριώματος στο μικροπεριβάλλον της μήτρας και είναι σημαντικές για εφαρμογές μηχανικής οστικής ιστού.In the present study we aim at extending our previous observations on the osteogenesis supporting capacity of 40:60% chitosan/gelatin (CS/Gel) scaffolds, by evaluating the composition of extracellular matrix (ECM) produced by human bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) undergoing osteogenic differentiation on these scaffolds. BM-MSCs were characterized based on their morphologic/immunophenotypic characteristics and their osteogenic/adipogenic differentiation potential. BM-MSCs were cultured on the scaffolds or on tissue culture polystyrene (TCPS) controls and induced towards osteocytes. The scaffolds’ osteogenic promoting capacity was demonstrated by the mRNA expression of the osteogenic markers RUNX2, ALP, OSC, DLX5. Notably, ALP and OSC mRNA expression was higher in the scaffolds compared to TCPS. A PCR array was used to assess the mRNA expression of 29 bone ECM-associated genes. We demonstrate, for the first time, the differential expression of 28/29 genes within the CS/Gel scaffolds compared to TCPS. Genes encoded for collagens type I A1 and type V A1, ECM protease inhibitors and osteopontin, among others, were significantly downregulated in the scaffolds, whereas genes encoding for ECM proteases and vitronectin were upregulated. Immunofluorescence data for the detection of the bone ECM proteins collagen type I A1, and osteopontin were in line with the PCR array results. In conclusion, we have provided a comprehensive characterization of bone ECM in cultures of human BM-MSCs differentiated towards osteocytes in CS/Gel scaffolds. Our findings are anticipated to contribute to better understanding of the complex cell-scaffold interactions within the matrix microenvironment, and are of importance for bone tissue engineering applications