Utilização da actinomicina D como método de enucleação química de ovócitos bovinos destinados à transferência nuclear.

A clonagem por Transferência Nuclear (TN) é uma técnica pouco eficiente e laboriosa. O processo, do ponto de vista técnico, é um dos principais fatores responsáveis pela quantidade e qualidade dos embriões produzidos. A enucleação é a etapa mais agressiva da TN. Apesar dos métodos alternativos propostos, a enucleação permanece sendo realizada como inicialmente descrita nos anos 50. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito do inibidor irreversível de transcrição e replicação actinomicina D (Fluka®, Suiça) como método de enucleação química de ovócitos. Ovócitos foram maturados in vitro (MIV) por 4 ou 6 horas e expostos a actinomicina D (T1, controle; T2 = 1,0 ?g mr1 / 16hs; T3 = 1,0 ?g ml-1 / 14hs; T 4 = 2,5 ?g ml-1 / 14hs; T5 = 5,0 ?g ml-1 / 14hs). Os ovócitos foram desnudados após 20 horas de MIV e ativados com 24-26 horas de MIV. As taxas de clivagem foram avaliadas 48 horas após a ativação (D2) e as de blastocisto após 168 (D7) e 192 (D8) horas de cultivo. Parte dos ovócitos foi fixada e corada com lacmóide ou orceína para determinação da fase da meiose ou para visualização da morfologia dos cromossomos, respectivamente. Posteriormente, ovócitos tratados com actinomicina D foram utilizados para clonagem por TN, sendo que parte dos embriões (D3) foi fixada para avaliar o percentual de células apoptóticas através do teste de TUNEL. Os dados relativos às taxas de maturação, clivagem e blastocisto foram analisados pelo teste do Qui-quadrado e os percentuais de apoptose pelo teste de Mann-Whitney. A taxa de maturação (T1 = 90,4%; T2 = 82,3%; T3 = 79,1%; T4 = 83,4%; T5 = 74,7%), clivagem (T1 = 68,9%; T2 = 46,0%; T3 = 49,7%; T4= 33,4; T5= 29,3%) e de blastocisto em D8 (T1 = 41,1%; T2 = 1,4%; T3= 1,3%; T4= 0,9%; T5= 0,0%) após o tratamento com actinomicina D foi significativamente menor. Dos ovócitos fixados, 63,2% estavam em metáfase ll (Mll). Ao avaliar os cromossomos, foi observada uma descondensação significativa com as concentrações mais altas (2,5 e 5,0 ?g ml-1). Os demais tratamentos não apresentaram modificações perceptíveis. Ovócitos tratados com 1,0 ?g ml-1 por 14 horas foram utilizados como citoplasmas receptores. A taxa de clivagem dos embriões reconstruídos (61,3%) foi semelhante ao grupo partenogenético tratado (61,3%) e inferior ao não tratado com actinomicina D (70,2%), embora a taxa de blastocisto tenha sido mais alta no grupo de TN (11,8%) em relação ao controle tratado (3,6%) e inferior ao controle sem tratamento (38,0%). Ao analisar o índice apoptótico dos embriões, os embriões partenogenéticos tratados tiveram um índice maior que os partenogenéticos não tratados (24,2% contra 4,8%). No entanto, os embriões oriundos de TN com ovócito tratado não foram diferentes estatisticamente dos TN controle (9,3 contra 13,0%). A actinomicina D é eficiente no bloqueio da transcrição e replicação embrionária. Além disso, foi possível obter embriões reconstruídos que apresentavam percentual de células apoptóticas indistinguível do controle.Dissertação (Mestrado em Ciências Agrárias) - Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, Brasília, DF. Orientador: Rodolfo Rumpf, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia