Mecanismos citotóxicos da galactomanana de sementes de Schizolobium amazonicum e seus complexos com oxovanádio em células de hepatocarcinoma humano (HepG2) e efeito do silenciamento da enzima glucose-6-fosfato isomerase (GPI) na sobrevivência de células de adenocarcinoma de cólon humano (LS174T)

Orientadora : Profª. Drª. Guilhermina Rodrigues NoletoCoorientadora : Profª. Drª. Carmen Lúcia de Oliveira PetkowiczCoorientadora : Profª. Drª. Silvia Maria Suter Correia CadenaTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 07/07/2017Inclui referências: fls. 138-159Resumo: Nesse estudo, foi avaliada a toxicidade de preparações de galactomananas isoladas de sementes de Schizolobium amazonicum e de seus complexos com oxovanádio em células HepG2, com enfoque nos efeitos sobre o metabolismo energético. A galactomanana nativa (SAGM) foi obtida do endosperma das sementes de S. amazonicum por extração aquosa a 25 ºC. O polímero nativo foi submetido à hidrólise ácida parcial resultando na fração MSAGM. A comparação dos perfis de eluição por HPSEC/MALLS/RI das galactomananas nativa e modificada confirmou a hidrólise parcial. A massa molecular de MSAGM obtida por MALLS foi de 1,56 x 104 g/mol. A razão Man:Gal de 3,2:1, determidada por GC, não foi alterada em relação a galactomanana nativa. SAGM e MSAGM foram complexadas com oxovanádio, sendo denominadas SAGM:VO e MSAGM:VO, respectivamente. A complexação dos biopolímeros com oxovanádio (IV/V) foi caracterizada por titulação potenciométrica, FT-IR, RMN 51V e 13C. A técnica de absorção atômica foi utilizada para determinar a presença do metal nos complexos. Os valores das constantes de complexação para os equilíbrios químicos foram similares para ambas as preparações, exceto para o equilíbrio [L2(OH)2(VO)2]/[L]2.[OH]2.[VO]2 que foi detectado apenas para MSAGM:VO. Para o complexo SAGM:VO o conteúdo de vanádio foi 3,8 vezes maior ao do complexo MSAGM:VO. Dentre os polímeros, SAGM e MSAGM:VO promoveram maior redução (~ 50%) na viabilidade das células HepG2 na concentração de 250 ?g/mL durante 72h de incubação. Nas mesmas condições somente MSAGM:VO (250 ?g/mL) promoveu inibição de ~50% na proliferação destas células. Ambos os polímeros também inibiram todos os estados da respiração (basal: ~70%; desacoplado: ~80%, e leak: ~40%). Este efeito se repetiu também em células permeabilizadas, nas quais foi observada a inibição da respiração em ~50%, que se manteve após a adição de ADP, glutamato/malato e succinato, estes últimos substratos para os complexos I e II, respectivamente. A concentração de lactato das células HepG2 incubadas com SAGM (250 ?g/mL) por 72h aumentou em ~25%, porém para SAGM:VO, MSAGM e MSAGM:VO (250 ?g/mL) houve redução de ~20%. Nas mesmas condições, a presença dos biopolímeros não alterou significativamente a concentração de piruvato. Os níveis de ATP foram reduzidos em ~30% após o tratamento de 72h com 250 ?g/mL com todas as preparações. MSAGM:VO aumentou os níveis de ROS em ~149%, enquanto o potencial transmembrana mitocondrial (??m) foi reduzido em ~47%. A análise da morte celular em condição de normóxia, após 72 h, mostrou que MSAGM:VO (250 ?g/mL) promoveu o aumento da atividade de caspases (3 e 7) envolvidas na morte celular por apoptose e, em menor intensidade, a proteína pro-apoptótica BAX. Porém, em condições de hipóxia, o biopolímero aumentou a expressão das proteínas anti-apoptóticas MCL-1 e BCL-XL. Também nesta condição (hipóxia), o tratamento com MSAGM:VO promoveu aumento das proteínas LC3-II e redução de p62, sugerindo o processo de autofagia. Os níveis de expressão de HIF-1? em condições de hipóxia foram reduzidos após o tratamento com MSAGM:VO (250 ?g/mL e 72h). Esses resultados demonstram que as preparações das galactomananas de S. amazonicum, especialmente, SAGM e MSAGM:VO, tornam as células HepG2 suscetíveis a morte e sugerem que estes polímeros tem potencial atividade antitumoral, motivando estudos futuros que viabilizem sua aplicação terapêutica. Além do estudo realizado com as galactomananas de S. amazonicum, o outro objetivo desse estudo foi avaliar o impacto do silenciamento da enzima glucose - 6 - fosfato isomerase (GPI) em células LS174T. GPI é uma enzima citosólica que realiza a interconversão de glucose - 6 - fosfato em frutose - 6 - fosfato. A interrupção genética desta enzima em células LS174T (GPIKO) foi realizada de forma a desviar o metabolismo dessas células para a via das pentoses fosfato. Após o silenciamento de GPI, em condições de normóxia, foi observado uma redução de glucose e lactato, reprogramando as células GPIKO para a fosforilação oxidativa de forma a elevar os níveis de ATP mitocondrial, mantendo assim a viabilidade. A incubação com fenformina nas células GPIKO, levaram as células a morte, indicando sensibilidade ao inibidor do complexo I da cadeia de transporte de elétrons. Em condições de hipóxia, GPIKO teve seu crescimento celular reduzido, caracterizado pela diminuição da proliferação e respiração celular. Apesar da restrição do crescimento in vitro sob hipóxia, o crescimento tumoral in vivo reduziu moderamente em comparação ao tipo selvagem, o qual não apresentava a mutação. Esses resultados indicam que a utilização exclusiva do metabolismo oxidativo tem a capacidade de fornecer precursores metabólicos para o crescimento tumoral, apontando a plasticidade do metabolismo das células tumorais apresentarem uma forte limitação para estratégias antitumorais. Palavras - chave: galactomananas; oxovanadio (IV/V); células HepG2; células LS174T; GPI; metabolismo; efeitos citotóxicos; antitumoral; hipóxia.Abstract: The aim of this study, was evaluated the toxicity of galactomannan preparations isolated from seeds of S. amazonicum and its complexes with oxovanadium in HepG2 cells, focusing on effects of energy metabolism. Native galactomannan (SAGM) was obtained from endosperm of S. amazonicum seeds by aqueous extraction at 25 ºC. SAGM was subjected to partial acid hydrolysis resulting in the MSAGM fraction. HPSEC/MALLS/RI elution profiles of native and modified galactomannans confirmed partial hydrolysis. Molecular mass of MSAGM obtained by MALLS was 1.56 × 104 g/mol. The Man: Gal ratio of 3.2:1 determined by GC, was not modified in relation to SAGM. SAGM and its partially hydrolyzed form (MSAGM) were complexed with oxovanadium, and was called SAGM:VO and MSAGM:VO, respectively. The complexation of biopolymers with oxovanadium (IV/ V) was characterized by potentiometric titration, FT-IR, NMR 51V, 13C. Atomic absorption technique was used to determine the presence of the metal in the complexes. The values of the complexation constants for the chemical equilibria were similar for both preparations, except for the equilibrium [L2(OH)2(VO)2]/[L]2.[OH]2.[VO]2 that was detected only for MSAGM:VO. For SAGM:VO complex the vanadium content was 3.8 fold greater than MSAGM:VO complex. Among the polymers, SAGM and MSAGM:VO promoted a greater reduction (~ 50%) in the viability of HepG2 cells at concentration of 250 ?g/mL during 72h of incubation. Under the same conditions only MSAGM:VO promoted ~ 50% of inhibition in the proliferation of these cells. Both polymers also inhibited all states of respiration (basal: ~ 70%, decoupled: ~ 80%, and leak: ~ 40%). This effect was also repeated in permeabilized cells, in which respiration inhibition was observed in ~ 50%, which was maintained after the addition of ADP, glutamate/malate and succinate (substrates for complexes I and II, respectively). Lactate concentration of HepG2 cells incubated with SAGM (250 ?g/mL) for 72h increased by ~ 25%, but for SAGM:VO, MSAGM and MSAGM:VO, there was a ~ 20% reduction. Under the same conditions, the presence of the biopolymers did not significantly alter the concentration of pyruvate. ATP levels were reduced by ~ 30% after treatment of 72 h at 250 ?g/ml with all preparations. MSAGM:VO increased ROS levels by ~ 149%, while mitochondrial transmembrane potential (??m) was reduced by ~ 47%. The analysis of cell death in normoxic condition, after 72h, showed that MSAGM:VO (250 ?g / mL) promoted an increase of caspase activity (3 and 7) and, to a lesser extent, protein BAX. However, under hypoxia conditions, the biopolymer increased expression of the anti-apoptotic proteins MCL- 1 and BCL-XL. Also in this condition, treatment with MSAGM:VO promoted increase of LC3-II proteins and reduction of p62, suggesting the autophagy process. Expression levels of HIF-1? under hypoxia conditions were reduced after treatment with MSAGM:VO (250 ?g/mL and 72 h). These results demonstrate that the preparations of galactomannans from S. amazonicum, especially SAGM and MSAGM:VO, render HepG2 cells susceptible to death and suggest that these polymers have a potential antitumor activity, motivating future studies that allow their therapeutic application. In addition to the study carried out with galactomannans from S. amazonicum, the other aim of this study was to evaluate the impact of disruption glucose - 6 - phosphate isomerase (GPI) on LS174T cells. GPI is a cytosolic enzyme that performs glucose - 6 - phosphate interconversion to fructose - 6 - phosphate. Genetic disruption of this enzyme in LS174T cells (GPIKO) was performed in a way to divert the metabolism of these cells to the phosphate pentose pathway. After GPI silencing under conditions of normoxia, a reduction of glucose and lactate was observed, reprogramming GPIKO cells for oxidative phosphorylation in order to raise mitochondrial ATP levels, thus maintaining viability. Incubation with phenformin in GPIKO cells led the cells to death, indicating sensitivity to the inhibitor of the complex I of the electron transport chain. Under hypoxia conditions, GPIKO had a reduced cell growth, characterized by decreased proliferation and cellular respiration. Despite in vitro growth restriction under hypoxia, tumor growth in vivo moderately reduced compared to wild type, which did not show the mutation. These results indicate that the exclusive use of oxidative metabolism has the ability to provide metabolic precursors for tumor growth, pointing out that the plasticity of tumor cell metabolism has a strong limitation for antitumor strategies. Key - words: galactomannan; Oxovanadium (IV/V); HepG2 cells; LS174T cells; metabolism; GPI; Cytotoxic effects; Antitumor; Hypoxia