Isolamento e caracterização molecular de três quitinases de uma biblioteca metagenômica

Orientadora : Profª Drª Carmen Lúcia de Oliveira PetkowiczDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 17/02/2011Inclui referênciasResumo: A Metagenômica permite a aplicação de técnicas de biologia molecular em organismos não cultiváveis e têm tido um grande impacto na descoberta de novas enzimas. Para identificação de novos genes de enzimas hidrolíticas foram analisadas duas bibliotecas metagenômicas: uma do solo da Mata Atlântica paranaense (MAF) e outra do solo contaminado por gordura de uma planta de tratamento de resíduos industriais (SLP). Essas bibliotecas foram estocadas na forma de conjuntos de clones contendo 100.000 e 500.000 clones, respectivamente, com um tamanho médio de inserto de 30 kb clonados no vetor osmidial pCC2FOS. A triagem funcional foi realizada em meio sólido LA contendo um substrato específico para proteases (1% leite em pó desnatado), amilases (1% amido), celulases (0.2% carboximetilcelulose) ou quitinases (2% quitina coloidal). Como resultado foram encontrados 23 clones positivos para protease e 17 para quitinase pertencentes às duas bibliotecas. Análise de restrição com as endonucleases BamHI e EcoRI revelou três padrões diferentes para os clones de protease e quatro padrões para os de quitinase. Todos os clones positivos foram retransformados e somente o clone CHI1 manteve atividade quitinolítica. Uma sub-biblioteca de CHI1 foi construída em pUC18 e os plasmídeos dos subclones com atividade foram purificados e submetidos a mutagênese por inserção de transposon. As extremidades dos insertos de DNA de todos os subclones e mutantes com inserção de transposon foram sequenciados para obtenção de sequências consenso estendidas. A comparação dessas sequências com o GenBank através da ferramenta BlastX revelou três genes de quitinase com identidades entre 78 e 93% com Chi1 de Aeromonas punctata (Chit1), um endoquitinase básica de A. hydrophila (Chit2) e uma quitodextrinase de A. hydrophila subsp. hydrophila (Chit3). No PDB poucas estruturas similares estão disponíveis e o programa Modeller foi utilizado para construir um modelo de estrutura por homologia somente para o gene da Chit1, que apresentou 75% de identidade com a sequência de aminoácidos da estrutura de ChiA de Serratia marcescens. Os outros genes apresentaram cerca de 30% de identidade com Chi2 de Carica papaya e ChiB de S. marcescens, respectivamente. Chit1 e 3 pertencem a família 18 das glicosil hidrolases e a análise de suas sequências identificou-as como exoquitinases secretadas. Chi2 pertence a família 19 das glicosil hidrolases, geralmente encontradas em plantas, e também possui um domínio de lisozima que pode fornecer uma atividade antibacteriana. Quitinases podem ter atividade antifúngica e antibacteriana, além de erem utilizadas na produção de quito-oligômeros e N-acetilglucosamina. Essas moléculas são aplicadas como promotores de crescimento em plantas, imunoestimuladores, agentes antitumorais e antibacterianos. Os três genes de quitinases são novos e possuem potencial de aplicação como agentes de biocontrole e na produção de derivados de quitina.Abstract: Metagenomics allows the application of molecular genomics to consortia of noncultivable microbes and has had substantial impact on the discovery of novel industrial enzymes. In order to identify new genes of hidrolytic enzymes we screened two fosmid metagenomic libraries; one from Atlantic Forest soil (MAF) and another from an animal fat-contaminated soil from an industrial wastewater treatment plant (SLP). These libraries were stored as pools and have 100,000 and 500,000 clones, respectively, with an average insert size of 30 kb cloned into the pCC2FOS fosmid vector. Functional screening was carried out on LB agar plates containing specific substrates for proteases (1% skimmed milk), amylases (1% starch), cellulases (0.2% carboximethylcellulose) and chitinases (colloidal chitin). As a result, 23 protease positive and 17 chitinase positive clones were found in the SLP and MAF libraries. Restriction analysis with BamHI and EcoRI endonucleases revealed three different restriction patterns among the protease activity bearing fosmids nd four patterns mong those conferring chitinase activity. All positive clones were retransformed and only clone CHI1 retained chitinase activity. A plasmid sub-library of CHI1 was constructed in pUC18 and subclone plasmids with activity were purified and submitted to transposon insertion mutagenesis. All subclones and transposon insertions mutants were sequenced. Contigs obtained were analysed with BlastX and three chitinases genes were found revealing identities between 78 and 93% with chiti ase 1 from Aeromonas punctata (Chit1), basic endonuclease from A. hydrophila (Chit2) and chitodextrinase from A. hydrophila subsp. hydrophila (Chit3). On PDB few similar structures were available and the Modeller software was used to construct an homology structure model for Chit1 gene that presents 75% identity with ChiA from Serratia marcescens. Other genes had 30% similarity to structures of Chi2 from Carica papaya and ChiB from S. marcescens, respectively. Chit1 and 3 belong to glycosil hydrolases family 18, and sequence analysis identified them as secreted exochitinases. Chi2 belongs to glycosil hydrolases family 19, generally found in plants, and also have a lysozyme domain that can provide an antibacterial activity. Chitinases may have antifungal and antibacterial activity and are used on chitooligomers and GlcNAc production. These compounds are applied as growth promoters in plants, imunoenhancers, antitumoral and antibacterial agents. The hree chitinases are new genes with potential application as biocontrol agents and on chitin derivatives production