Ação antioxidante de extrato padronizado de Ginkgo biloba em eritrócitos de indivíduos normais e de portadores de anemia falciforme, submetidos à sobrecarga oxidativa, in vitro

Orientador : Prof. Dr. Aguinaldo José do NascimentoCoorientadora : Profa. Drª Maria Suely Soares LeonartDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 30/03/2011Bibliografia: fls. 109-118Área de concentração: Insumos, medicamentos e correlatosResumo: O eritrocito e um modelo celular adequado para o estudo do efeito das especies reativas de oxigenio (ERO) e para a triagem inicial de substancias antioxidantes, devido a sua simplicidade estrutural, acessibilidade e vulnerabilidade a oxidacao. As ERO sao formadas fisiologicamente nas celulas, porem seu excesso esta relacionado com o envelhecimento celular e eventos patologicos. A doenca falciforme promove uma anemia hemolitica caracterizada pela presenca de alta concentracao de hemoglobina S, cujas consequencias incluem a producao aumentada de ERO e a diminuicao da capacidade de defesa antioxidante, acarretando disfuncao endotelial, disturbios de coagulacao e hemolise intravascular. No presente trabalho, comparou-se o estado oxidativo dos eritrocitos de pacientes com anemia falciforme (genotipo SS) e de individuos normais (genotipo AA) atraves da determinacao de glutationa reduzida (GSH), metahemoglobina (meta-Hb) e dosagem de substancias reativas ao acido tiobarbiturico (TBARS). Os eritrocitos dos pacientes com anemia falciforme apresentaram um aumento da oxidacao da hemoglobina em 1,4 vezes e da peroxidacao lipidica em 1,8 vezes, nos seus estados basais. O estudo do estresse oxidativo foi realizado apos inducao de danos pelos oxidantes terc-butil-hidroperoxido (t-BHP) e 2,2 - azobis (amidinopropano) dihidrocloreto (AAPH), geradores de radicais livres em modelos celulares. Os eritrocitos de pacientes com anemia falciforme apresentaram maior suscetibilidade ao estresse oxidativo, com maior oxidacao da hemoglobina e um dano a membrana lipidica aproximadamente 1,4 vezes maior do que eritrocitos normais. Por fim, testou-se o efeito antioxidante do extrato padronizado de Ginkgo biloba (EGb 761) na prevencao dos danos oxidativos induzidos pelos oxidantes, in vitro. Os resultados obtidos ilustram que o EGb 761 apresenta acao antioxidante dose-dependente tanto em eritrocitos de individuos normais quanto de pacientes com anemia falciforme, prevenindo parcialmente a peroxidacao lipidica da membrana induzida por t-BHP (IC50 de 138,4 e 257,0 ƒÊg/ml, em eritrocitos AA e SS, respectivamente) inibindo a formacao de radicais livres induzida pelo t-BHP (IC50 de 4,22 e 13,0 ƒÊg/ml, respectivamente) e prevenindo a hemolise induzida por AAPH (IC50 de 2,6 e 6,0 ƒÊg/ml, respectivamente). De acordo com os resultados, em eritrocitos de pacientes com anemia falciforme a dose necessaria para realizar o mesmo efeito foi no minimo 2 vezes maior do que nos eritrocitos de individuos normais. Por outro lado, o EGb 761 nao conseguiu prevenir a oxidacao da hemoglobina e da molecula de GSH nas concentracoes testadas. Ensaios clinicos sao necessarios para investigar os possiveis beneficios do EGb 761 como adjuvante terapeutico na anemia falciforme.Abstract: The erythrocyte is a model for the study of the effect of reactive oxygen species (ROS) and the initial antioxidant screening due to its structural simplicity, accessibility and vulnerability to oxidation. ROS are formed physiologically in cells, but its excess is related to cellular aging and pathological events. Sickle cell disease promotes a hemolytic anemia characterized by the presence of high concentrations of hemoglobin S, whose consequences include the increased production of ROS and decreased antioxidant defense capacity, resulting in endothelial dysfunction, coagulation disorders and intravascular hemolysis. In this work, we compared the oxidative status of erythrocytes from patients with sickle cell anemia (SS genotype) and in normal controls (genotype AA) through the determination of reduced glutathione (GSH), methemoglobin (met-Hb) and serum substances reactives to thiobarbituric acid (TBARS). Erythrocytes of patients with sickle cell anemia had an increase of 1.4 in hemoglobin oxidation and 1.8 times in lipid peroxidation over their basal state. The study on oxidative stress was performed after induction of oxidative damage by terc-butylhydroperoxide (t-BHP) and 2,2 - azobis (amidinopropane) dihidrochloride (AAPH), generators of free radicals in cell models. The erythrocytes of sickle cell patients showed increased susceptibility to oxidative stress, with higher hemoglobin oxidation and lipid membrane damage approximately 1.4 times higher than normal ones. Finally, we tested the antioxidant effect of standardized extract of Ginkgo biloba extract (EGb 761) in preventing oxidative damage induced by oxidants in vitro. The results illustrate that EGb 761 has ntioxidant activity in erythrocytes from both normal subjects and patients with sickle cell disease, partially preventing membrane lipid peroxidation (IC50 of 138.4 ìg/ml and 257.0 ìg/ml, respectively), inhibiting the formation of free radicals (IC50 of 4.22 ìg/ml in AA and 13.0 ìg/ml in SS) and preventing hemolysis (IC50 de 2.6 ìg/ml in AA and 6.0 ìg/ml in SS). According to the results, extract antioxidant action was ose-dependent, and in erythrocytes from sickle cell patients the dose required to achieve the same effect was at least twice higher than in erythrocytes of normal individuals. Moreover, EGb 761 failed to prevent oxidation of the hemoglobin and GSH, at the concentrations tested. Clinical trials are needed to investigate the possible benefits of EGb 761 as an adjuvant in sickle cell anemia therapy