Padrão de migração das células da crista neural cefálica em embriões de ave após exposição ao chumbo

Orientadora: Profª. Drª. Claudia Feijó Ortolani-MachadoCoorientador: Prof. Dr. Edvaldo da Silva TrindadeDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 28/03/2018Inclui referências: p.106-122Resumo: A crista neural (CN) é uma população celular originada durante a neurulação. Estas células apresentam pluripotencialidade, originando vários tipos celulares, além de alta capacidade migratória e proliferativa. Muitos compostos podem interferir nessas células, ocasionando distúrbios migratórios e malformações no organismo em desenvolvimento. O chumbo é o metal tóxico mais comum no ambiente, sendo considerado um potente teratógeno. Até o momento não existem estudos sobre o efeito deste contaminante ao longo do tempo nas estruturas cefálicas em desenvolvimento de embriões de ave, sua biodisponibilidade e efeito sobre as células da CN. Assim, no presente trabalho esses parâmetros foram avaliados, buscando identificar o efeito do chumbo sobre o padrão migratório das células da CN cefálica. A exposição foi realizada injetando-se, na câmara de ar do ovo, solução de nitrato de Pb na concentração de 0,025 ?g.ml-1, ou solução fisiológica no controle, previamente à incubação. Os ovos foram incubados a 38°C por 1 a 4 dias, sendo a viabilidade dos embriões determinada após a abertura. A análise anatômica foi realizada utilizando-se estereomicroscópio e o padrão normal definido conforme descrito por Hamburger e Hamilton (1951). A presença do chumbo foi analisada empregando-se o marcador fluorescente Leadmium-Green e sua deposição nas células da região cefálica avaliada através de autometalografia. A quantificação do metal foi realizada por análise química com ICP-MS. O padrão migratório das células da CN foi avaliado com imunomarcador (anti-HNK-1), nos estádios 8-18HH para acompanhar a delaminação e migração dessas células. Os embriões expostos ao chumbo apresentaram um aumento crescente de mortalidade e na ocorrência de malformações. Das alterações encontradas destacam-se malformação na região cefálica e presença de pontos hemorrágicos. A marcação positiva para Leadmium-Green foi observada apenas nos embriões expostos, confirmando a presença do chumbo. Nas células ao nível dos rombômeros o metal foi localizado no citoplasma, núcleo ou em ambos. Não foi observado um padrão na deposição, porém foram encontrados acúmulos celulares anormais na luz do tubo neural, sendo que algumas células nestes acúmulos apresentavam marcação sutil para Pb e foram positivas para anti-HNK1, indicando serem células da CN. A quantificação química mostrou que apenas 25% do chumbo inserido na câmara de ar está presente nos embriões. Mesmo em concentrações baixas a exposição ao chumbo é seguida por anomalias de distribuição das células da CN em diversos níveis cefálicos. A localização ectópica dessas células no lúmen do tubo neural, os padrões teciduais e a alteração na rota migratória é condizente com as alterações cumulativas descritas na literatura, como fenótipos corporais aberrantes e anormalidades morfofuncionais. Assim, a correlação entre as alterações relatadas indica que o chumbo altera o padrão migratório das células da CN e o embrião exposto tem alta probabilidade de apresentar malformações e futuramente déficits funcionais nas regiões cranio-faciais. Palavras-chave: Gallus gallus. Metal pesado. Biodisponibilidade. Embriotoxicologia.Abstract: The neural crest (CN) is a cell population originated during neurulation. These cells present pluripotentiality, originating sundry cell types, besides high migratory and proliferative capacity. Numerous compounds may interfere with these cells, modifying formation or migration, thus inducing disorders and malformations in the developing organism. Lead (Pb) is the most common toxic metal in the environment, being considered a powerful teratogen. To date there are no studies on the effect of this contaminant on developing cephalic structures of avian embryos over time, their bioavailability and effect on CN cells. Thus, in the present work these parameters were evaluated, seeking to identify the effect of lead on the migratory pattern of cephalic CN cells. The exposure was performed by injecting, into the egg air chamber, Pb nitrate solution at the concentration of 0,025 ?g.ml-1, or physiological solution in the control, prior to incubation. The eggs were incubated at 38°C for 1 to 4 days, with embryo viability being determined after opening. Anatomical analysis was performed under stereomicroscope and the normal pattern defined as described by Hamburger and Hamilton (1951). The presence of lead was analyzed using the Leadmium-Green fluorescent marker and its deposition in cephalic region cells evaluated by autometalography. Metal quantification was performed by chemical analysis with ICP-MS. The migratory pattern of CN cells was assessed with immunoreactor (anti-HNK-1) at 8-18HH stages to monitor delamination and migration of these cells. Embryos exposed to lead presented an increasing mortality and malformations occurrence. The alterations found were mainly malformations in the cephalic region and the presence of hemorrhagic points. Positive labeling for Leadmium-Green was observed only in exposed embryos, confirming the presence of lead. In cells at the level of the rhombomers the metal was located in the cytoplasm, nucleus or both. No deposition pattern was found, but abnormal cell clusters were observed in the lumen of the neural tube, and some cells in these clusters had subtle labeling for Pb and were anti-HNK1 positive, indicating that they were CN cells. The chemical quantification revealed that only 25% of the lead injected into the air chamber is present in the embryos. Even at low concentrations lead exposure is followed by abnormalities on distribution of CN cells at various cephalic levels. The ectopic location of these cells in the neural tube lumen, tissue patterns, and alteration in the migratory route is consistent with the cumulative changes described in the literature, such as aberrant body phenotypes and morphofunctional abnormalities. Thus, the correlation between the reported changes indicates that lead alters the migratory pattern of CN cells and the exposed embryo has a high probability of presenting malformations and future functional deficits in craniofacial regions. Keywords: Gallus gallus. Heavy metal. Bioavailability. Embryotoxicology