Construção e caracterização de um replicon e clone infeccioso de uma cepa brasileira de dengue sorotipo 3 (BR Den3 290-02)

Orientadora : Dra. Claudia Nunes Duarte dos SantosTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : 26/05/2009Bibliografia: f.88-105Área de Concentração: Biologia MolecularResumo: Os vírus da dengue pertencem ao gênero Flavivírus, família Flaviviridae e são vírus ARN simples fita com um genoma de ~11kb. O seu genoma é flanqueado por regiões não codificadoras e codifica três proteínas estruturais (C, prM e E) e sete não-estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) as quais são traduzidas em uma poliproteína e processadas pela protease viral e proteases do hospedeiro. Atualmente a dengue constitui a arbovirose mais comum que afeta os seres humanos, no entanto até o presente não existem tratamento específico ou vacinas disponíveis. As manifestações clínicas abrangem desde estados assintomáticos até a dengue hemorrágica/síndrome do choque por dengue. Os mecanismos envolvidos na patogênese da doença não são bem compreendidos e ainda representam um desafio. O desfecho parece ser o resultado de uma combinação de fatores virais e do hospedeiro. Nesse contexto o uso do sistema subgenômico de replicon e do clone infeccioso representam instrumentos de pesquisa poderosos, pois permitem o estudo de marcadores de virulência podendo contribuir para um melhor entendimento da patogênese da dengue e eventualmente dirigir intervenções tais como terapias antivirais. Eles possibilitam definir o papel de mutações nas proteínas virais, estudar o processo de replicação viral e inclusive testar drogas antivirais. Nosso objetivo foi gerar e caracterizar biologicamente o replicon e o clone infeccioso de um isolado clínico recente de dengue sorotipo 3. A fim de alcançar nosso objetivo primeiramente clonamos diferentes segmentos do genoma viral amplificados por RT-PCR em um vetor pGEM®-T-easy. Todos os clones foram sequenciados e utilizados na montagem do replicon e clone infeccioso em vetores de baixa cópia (pBAC e pAC) contendo o promotor da T7 ARN polimerase e uma sequência de ribozima. A maioria dos procedimentos de clonagem foi realizada na cepa Top10 de E. coli. Após a obtenção de um clone estável do replicon, esse foi utilizado na transcrição in vitro e transfecção de células C6/36 de mosquito. As células foram analisadas por imunofluorescência indireta com o uso de anticorpos policlonais anti-dengue 3 em diferentes tempos (48, 72, 96 e 120h) póstransfecção. Os resultados mostraram que o replicon foi eficientemente transfectado e replicou nas células. Também foi possível observar que proteínas virais foram reconhecidas pelo anticorpo policlonal, no entanto nenhuma partícula viral foi produzida. Infelizmente nós ainda não tivemos sucesso na montagem do clone infeccioso, porém esse trabalho assim como a inserção de marcadores moleculares no sistema de replicon ainda estão em progresso.Abstact: Dengue viruses belong to the genus Flavivirus, family Flaviviridae and are single stranded RNA viruses with a genome of ~11kb. Its genome is flanked by non-coding regions and codes for three structural (C, prM and E) and seven non-structural proteins (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B and NS5) which are translated into a polyprotein and processed by viral and host proteases. Currently dengue is considered the most common arboviral disease afflicting men, however there are no specific treatment or efficient vaccines available yet. The clinical manifestations can range from asymptomatic to dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome. The mechanisms involved in the disease pathogenesis are not well understood and are still a challenge. The outcome seems to be the result of a combination of viral and host factors. In this context the use of the subgenomic replicon system and the infectious clone system represent powerful research instruments as they allow the study of molecular markers of virulence, contributing to a better understanding of dengue pathogenesis and eventually directing interventions such as antiviral therapy. They can be used: to define the role of mutations in the viral proteins, to study viral replication and even to test antiviral drugs. Our objective was to generate and characterize biologically a replicon and infectious clone from a recent clinical isolate of dengue virus serotype 3. To achieve our objective we first cloned different RT-PCR fragments from the viral genome in the pGEM®-T-easy vector. All clones were sequenced and used to assemble the replicon and the infectious clone in low copy vectors (pBAC and pAC) containing a T7 RNA polymerase promoter and a ribozyme sequence. Most cloning procedures were done using Top10 E. coli strain. After the generation of a stable replicon clone, it was used for in vitro transcription and transfection in C6/36 mosquito cells. Cells were analyzed by indirect immunofluorescence using anti-dengue 3 polyclonal antibodies at different time points (48, 72, 96 and 120h) posttransfection. The results showed that the replicon was efficiently transfected and replicated in the cells. We also observed that the viral proteins could be recognized by the polyclonal antibody, but no virus particle was produced. Unfortunately we have not yet succeeded to assemble the infectious clone, but this as well as the insertion of molecular markers in the replicon system, are works still in progress