Caracterização de TcKAP7 : uma proteína associada ao cinetoplasto do protozoário Trypanosoma cruzi

Orientador : Dr. Stenio Perdigão FragosoTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 26/02/2015Inclui referências : f. 103-115Resumo: O DNA do cinetoplasto (kDNA) dos tripanosomatídeos consiste numa rede de moléculas circulares catenadas entre si: os minicírculos e os maxicírculos. Os minicírculos codificam RNAs guias (gRNAs) e os maxicírculos codificam para algumas subunidades de enzimas mitocondriais e rRNA, em um padrão criptografado (edição de RNA). Estudos com o tripanosomatídeo Crithidia fasciculata mostraram que proteínas do tipo histona H1 associadas ao cinetoplasto (KAPs) são capazes de condensar a rede de kDNA. Porém, pouco é conhecido sobre estas proteínas de Trypanosoma cruzi, um protozoário parasita que sofre alterações na estrutura do DNA do cinetoplasto ao longo de seu ciclo de vida. Neste trabalho foi caracterizada uma proteína associada ao cinetoplasto de T. cruzi, denominada de TcKAP7, que possui baixo peso molecular e natureza básica, condizente com um papel na neutralização de carga e na condensação do DNA. Através de ensaios usando a técnica de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) foi possível perceber que a proteína TcKAP7 sofre mudanças estruturais na presença do kDNA, sugerindo uma interação com essa estrutura, seja através de ligações eletrostáticas ou através de ligações específicas com moléculas presentes na rede. A análise pela técnica de imunofluorescência mostrou que proteína TcKAP7 está localizada na região dos pólos do cinetoplasto, o que sugere que pode estar envolvida na finalização da replicação dos minicírculos. Mutante nulo para TcKAP7 foi gerado por técnicas de substituição gênica, a fim de verificar se na ausência de TcKAP7 ocorriam alterações na estrutura do kDNA. Contudo, os parasitas mutantes para TcKAP7 não apresentavam alterações na estrutura e morfologia do cinetoplasto, quando analisados por microscopia eletrônica e foram capazes de se diferenciar, sem perder a capacidade infectiva. Entretanto, ensaios de RNA de interferência visando analisar a função do gene TbKAP7, ortólogo em T. brucei, levou à redução da proliferação celular das formas procíclicas desse parasita, mostrando que este gene é essencial para o metabolismo desse tripanosomatídeo, sugerindo que KAP7 possa ter papeis distintos em T. cruzi e T. brucei. Palavras-chaves: Trypanosoma cruzi, cinetoplasto, nocaute, KAPs.Abstract: The kinetoplast DNA (kDNA) of trypanosomatids consists in a network of circular molecules catenated each other, the minicircles and maxicircles . The minicircles code RNAs guides (gRNAs) and the maxicircles code for some subunits of mitochondrial enzymes and rRNA in a cryptic pattern (RNA editing). Studies in the trypanosomatid protozoan Crithidia fasciculata showed that the kDNA is associated with histone H1-like proteins, known as kinetoplast-associated proteins (KAPs), wich are capable of condensing the kDNA network. However, little is known about these proteins of Trypanosoma cruzi, a protozoan parasite which undergoes changes in kinetoplast DNA structure over its life cycle. Here we characterize a protein associated with T. cruzi kinetoplast, named TcKAP7. TcKAP7 is a low molecular weight protein with basic nature, which is consistent with a role in DNA charge neutralization and condensation. Analysis by small angle X-Ray scattering technique (SAXS) revealed that the TcKAP7 protein undergoes structural changes in the presence kDNA, suggesting an interaction with this DNA network, either through electrostatic bonds or through specific binding to molecules present on the network. The immunofluoresce analysis showed that TcKAP7 is located in the kinetoplast poles, suggesting that TcKAP7 might be involved in the late stages of the minicircle replication. A null mutant for TcKAP7 was obtained by gene replacement techniques to study possible alterations in the kDNA structure. However, no modification in the structure and morphology of the kinetoplast was observed by electron microscopy. In addition, Tckap7 null mutant was able to differentiate without losing its infective capacity. Interference RNA assays was performed to analyze the function of TbKAP7, the ortholog gene in T. brucei. The ablation of TbKAP7 expression leaded to reduction in the procyclic proliferation, suggesting that this gene is essential for the metabolism of the parasite and might play distinct roles in T. cruzi and T. brucei Key-words: Trypanosoma cruzi, kinetoplast, gene knockout, KAPs