Pré-tratamento de bagaço de cana com CO2 supercrítico na presença de etanol e líquido iônico : pré-otimização das variáveis do processo e avaliação da acessibilidade do substratos produzidos

Orientador : Prof. Dr. Luiz Pereira RamosTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Exatas, Programa de Pós-Graduação em Química. Defesa: Curitiba, 24/02/2014Inclui referênciasResumo: Uma nova tecnologia de pré-tratamento de bagaço de cana-de-açúcar foi desenvolvida empregando dióxido de carbono supercrítico e etanol (scCO2/EtOH) na presença de acetato de 1-butil-metil-imidazólio (Bmim[OAc]). Os experimentos foram realizados por 2 h variando a temperatura (110 a 180 °C), a pressão (195 a 250 bar) e a quantidade de Bmim[OAc] em relação à massa seca de material (0:1 a 1:1 Bmim[OAc]/bagaço). De acordo com os resultados, a concentração de Bmim[OAc] e a pressão do sistema favorecem a deslignificação e o aumento no teor de anidroglucose no substrato, ao passo que o aumento da temperatura favorece a diminuição no teor de anidroxilose no substrato. Os melhores resultados proporcionaram 41 % de deslignificação gerando um substrato com teor de 74 % de polissacarídeos. Como resultado da deslignificação, ocorreu o aumento da acessibilidade do substrato à hidrólise enzimática, que gerou conversão de 70 % de glucanas em glucose e 92 % de xilanas em xilose após 12 h de reação quando empregados 10 mg g-1 de Cellic CTec2® (Novozymes) por substrato seco. Os líquidos iônicos (LI) contendo ânion acetato foram mais fáceis de recuperar após o pré-tratamento com scCO2/EtOH do que o LI contendo ânion cloreto, onde o emprego de Bmim[Cl] resultou em retenção de 25 % da massa inicial de LI no material, fato que levou a inativação das enzimas. Além disso, os LIs Bmim[OAc] e Emim[OAc] deslignificaram mais o material do que o Bmim[Cl], apresentando 42 %, 44 % e 36 % de deslignificação, respectivamente. Comportamento similar foi obtido para aumentos na distância interfibrilar de 44 %, 49 % e 9 %, e na largura do cristal de 17 %, 20 % e 9 %, respectivamente, ao passo que não foram encontradas variações estatisticamente significativas para os valores de índice de cristalinidade (CrIWAXS). A acessibilidade dos substratos à hidrólise foi investigada mediante avaliação da capacidade de diferentes preparações enzimáticas em liberar açúcares redutores totais (ARTot), insolúveis (ARInsol) e solúveis na presença de gluconolactona (ARISol). Tais medidas foram então utilizadas para expressar as atividades celulásica total, endoglucanásica e exoglucanásica, sendo a atividade -glucosidásica (AR?Sol) calculada pela subtração entre ARSol e ARISol. A hidrólise de celulose com enzimas purificadas revelou que tanto exoglucanases (ExG) quanto endoglucanases (EnG) do Trichoderma reseei atuam na degradação da celulose em duas etapas, a primeira gerando açúcares redutores insolúveis (ARInsol) e a segunda causando a diminuição destes com o concomitante aumento na produção de açúcares redutores solúveis (ARSol). Já os experimentos realizados empregando os preparados enzimáticos multi-componentes revelaram que o aumento na quantidade de EG-II em preparado contendo CHB-I aumentou linearmente a produção de ARTot na presença e na ausência de ?-glucosidase (?G). Na ausência de ?G, o grau de efeito de sinergia (DSE) devido à presença de EG-II em preparado contendo CBH-I foi majoritariamente maior que 1 para a produção de ARTot e ARInsol. Já na presença de ?G, o DSE para a produção de ARInsol manteve-se praticamente igual a 1, enquanto que estes valores foram maiores que 1 para a produção de ARTot ARISol e AR?Sol. Para a hidrólise dos substratos pré-tratados, a atividade ExG foi mais importante do que a atividade EnG e o pré-tratado na presença de Emim[OAc] apresentou maior suscetibilidade à hidrólise enzimática, comparado ao obtido na presença de Bmim[OAc], principalmente na presença de ?G. Na hidrólise dos substratos pré-tratados também foram identificados efeitos de sinergia entre EG-I e CBHII, sendo a sinergia na produção do ARTot principalmente gerada pela produção de ARInsol. Os valores de atividade específica aparente (AEA) para a hidrólise de papel de filtro Whatman N°1 demonstraram sinergia devido à presença de EG-II em preparado enzimático contendo CBH-I e de ?G em preparado contendo celulases, ao passo que estas variáveis provocaram diminuição nos valores de AEA para a hidrólise dos substratos pré-tratados na presença de LI. Com base nos dados obtidos, foi comprovado que, para o pré-tratamento por scCO2/EtOH-LI, o Bmim[OAc] apresentou-se como o melhor co-solvente, gerando um substrato de maior suscetibilidade à hidrólise enzimática devido à deslignificação e as mudanças na estrutura supramolecular da celulose. Palavras-chave: bagaço de cana, pré-tratamento, líquido iônico, dióxido de carbono supercrítico, hidrólise enzimática, sinergia.Abstract: A new pre-treatment technology of sugarcane bagasse was developed using supercritical carbon dioxide and ethanol (scCO2/EtOH) in the presence of 1-butyl-3-methyl-imidazolium acetate (Bmim[OAc]) as a co-solvent. The experiments were carried out along 2 h varying the temperature (110 °C to 180 °C), pressure (195 Bar to 250 Bar) and amount of Bmim[OAc] in relation to the dry mass of material (0:1 to 1:1 Bmim[OAc]:bagasse). According to the results, the concentration of Bmim[OAc] and pressure of the system favour the delignification and the content of anhydrousglucose on the substrate, while the increase of temperature favours the decrease on the anhydrousxylose content on the substrate. The best results provided 41 % of delignification generating a substrate with 74 % of polysaccharides content. As a result of the delignification, the increased substrate accessibility to enzymatic hydrolysis occurred, which led to 70 % of glucans conversion and 92 % of xylans conversion after 12 h of reaction when using 10 mg g-1 of Cellic CTec2® (Novozymes) per dry substrate. The ILs containing acetate anion showed to be easier to recovery after the pre-treatment with scCO2/EtOH than the IL containing chloride anion, where the using of Bmim[Cl] resulted on the retaining of 25 % of initial mass of IL on the material, fact that led to the inactivation of enzymes. Furthermore, the ILs Bmim[OAc] and Emim[OAc] removed more lignin than Bmim[Cl], showing 42 %, 44 % and 36 % of delignification, respectively. Similar behaviour was obtained to the increase on the interfibrillar distance of 44 %, 49 % and 9 %, and on crystal width of 17 %, 20 % and 9 %, respectively, while statistically significant differences were not found in the values of crystallinity index (CrIWAXS). The susceptibility of the substrates to the hydrolysis was investigated by assessing the ability of different enzymatic preparations on releasing total (RSTot), insoluble (RSInsol) and soluble reducing sugars on the presence of gluconolactone (RSISol). Such measures were then used to express the total cellulasic, endoglucanase and exoglucanase activities, being the ?-glucosidasic activity (AR?Sol) calculated by subtraction between RSSol and RSISol. The hydrolysis of cellulose with the purified enzymes revealed that both exoglucanases (ExG) and endoglucanases (EnG) from Trichoderma reseei act on the cellulose degradation in two steps, first generating RSInsol, and the second by the decrease of these RS and concomitant increase on the RSSol yield. On the other hand, the experiments carried out using multi-component enzymatic preparations revealed that increasing on the EG-II amount on preparations containing CBH-I increased linearly the total reducing sugars RSTot yield, in the presence and absence of ?-glucosidase (?G). In the absence of ?G, the degree of synergistic effect (DSE) due to the presence of EG-II on preparation containing CBH-I was majoring higher than 1 for the RSTot and RSInsol yields. However, in the presence of ?G the DSE for the RSInsol yield kept practically equals 1, while to the RSTot RSISol and RS?Sol yields were higher than 1. To the hydrolysis of pre-treated substrates, the ExG activity was more important than the EnG activity, and the pre-treated in the presence of Emim[OAc] showed higher susceptibility to the enzymatic hydrolysis, in comparison to the presence of Bmim[OAc], especially in the presence of ?G. On the hydrolysis on pre-treated substrates effects of synergy between EG-I and CBH-II were also identified, being the synergy caused on RSTot yield generated mainly by RSInsol yield. The values of Apparent Specific Activity (ASA) for the Whatman N°1 filter paper hydrolysis showed synergy due to the presence of EG-II on enzymatic preparation containing CBH-I and due ?G on enzymatic preparation containing cellulases, while that those variables caused decrease on the ASA values for the hydrolysis of pre-treated substrates in the presence of IL. Based on the obtained data, it was proven that for the pre-treatment by scCO2/EtOH-LI, the Bmim[OAc] showed as the best co-solvent, generating a substrate of higher susceptibility to the enzymatic hydrolysis, due to the delignification and changes on the supramolecular structure of cellulose. Key-words: sugarcane bagasse, pretreatment, ionic liquid, supercritical carbon dioxide, enzymatic hydrolysis, sinergism