Caracterização de isolados clínicos de aeromonas e sequenciamento do genoma de A. trota 1999LCR

Orientadora : Profª. Drª. Cynthia M. T. Fadel-PichethCoorientadora : Profª. Drª. Leda ChubatsuTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 30/11/2016Inclui referências : f. 66-79Área de concentração: Análises ClínicasResumo: Aeromonas são bacilos gram-negativos capazes de causar infecções em humanos que variam de diarreia a septicemia e raramente meningite. As espécies mais frequentemente associadas com infecções são A. hydrophila, A. caviae e A. veronii sobria, enquanto A. trota é raramente isolada de amostras clínicas e ainda é pouco estudada. A identificação dessas bactérias ao nível de espécie é difícil e requer a utilização de métodos moleculares para confirmação. O objetivo desse trabalho foi caracterizar isolados clínicos de Aeromonas previamente identificados através de testes microbiológicos e realizar o sequenciamento e anotação do genoma da estirpe A. trota 1999LCR. Oitenta e cinco Aeromonas foram analisadas através do sequenciamento de gyrB o que permitiu identificar as seguintes espécies: A. caviae (33), A. hydrophila (24), A. veronii bv sobria (22), A. media (4), A. aquariorum e A. trota 1 estirpe cada. A espécie A. media só foi identificada através do sequenciamento de gyrB. A concordância dos resultados da identificação convencional e molecular foi de 83,5%. Setenta e nove perfis de eletroforese em campo pulsado distintos foram observados entre 90 Aeromonas analisadas indicando elevada diversidade genética entre elas. Apenas 3 clusters, formados respectivamente por A. caviae (2 estirpes), A. veronii sobria (5 estirpes) e A. hydrophila (7 estirpes), foram identificados. Em relação às características fenotípicas 90 estirpes (100%) apresentaram motilidade tipo swimming, 51 (57%) motilidade tipo swarming e 63 (70%) a capacidade de formar biofilme. Estes resultados indicam que as bactérias analisadas expressam características associadas com adesão, etapa importante no processo de colonização. O sequenciamento da estirpe A. trota 1999LCR foi realizado utilizando os sequenciadores 454 GS Junior e Illumina Miseq, a montagem do genoma foi realizada com o software SPADES v.3.5.0 e a anotação automática com o programa Rapid Annotation of microbial genomes using Subsystems Technology (RAST) versão 4.0. O tamanho do genoma foi estimado em 4.33Mb alocados em 18 contigs, e conteúdo de C+G de 60%. A anotação automática do genoma identificou 3877 sequências codificadoras, 128 tRNAs e 4 operons de rRNA. Utilizando o RAST e a busca manual com BLASTP para determinantes de virulência já descritos em outras espécies de Aeromonas diversos genes associados com virulência foram identificados no genoma da estirpe 1999LCR. Destaca-se a presença de genes que codificam os flagelos polar e lateral, em concordância com os resultados de swimming e swarming desta bactéria; toxinas incluindo AerA (aerolisina), hemolisina III, hemolisina termoestável e hemolisina cupin-like, que podem estar associadas com a atividade hemolítica, previamente descrita, da bactéria contra eritrócitos humanos. Genes que codificam um Sistema de Secreção Tipo 6 (SST6), associado com atividades citotóxicas, apoptose e escape da fagocitose em outras espécies de Aeromonas, também foram identificados. Outras características associadas com virulência identificadas incluem adesinas, enterotoxina citotônica Alt, várias enzimas previamente associadas com invasão de tecidos do hospedeiro e um inibidor da lisozima da família Ivy que poderia proteger a bactéria da atividade lítica da enzima. Portanto, diversos genes que podem participar na patogênese da bactéria, foram identificados no genoma de A. trota 1999LCR.Abstract: Aeromonas are gram-negative bacilli capable of causing infections in humans ranging from diarrhea to septicemia and rarely meningitis. The species most frequently associated with infections are A. hydrophila, A. caviae and A. veronii sobria, while A. trota is rarely isolated from clinical samples and is still poorly studied. The identification of these bacteria at the species level is difficult and requires the use of molecular methods for confirmation. The objective of this work was to characterize clinical isolates of Aeromonas previously identified through microbiological tests and to carry out the sequencing and annotation of the genome of A. trota strain 1999LCR. Eighty-five Aeromonas were analyzed by gyrB sequencing which allowed the identification of the following species: A. caviae (33), A. hydrophila (24), A. veronii bv sobria (22), A. media (4), A. aquariorum and A. trota 1 strain each. The A. media species was identified only through the gyrB sequencing. The agreement between results of the conventional and molecular identification was 83.5%. Seventy-nine distinct pulsed field electrophoresis profiles were observed among the 90 Aeromonas analyzed indicating high genetic diversity between them. Only 3 clusters, formed by A. caviae (2 strains), A. veronii bv sobria (5 strains) and A. hydrophila (7 strains) were identified. In relation to the phenotypic characteristics, 90 strains (100%) exhibited the swimming motility, 51 (57%) the swarming motility, and 63 (70%) the ability to form biofilm. These results indicate that these bacteria are able to express characteristics associated with adhesion, an important step in the colonization process. Sequencing of the A. trota strain 1999LCR was performed using the 454 GS Junior and Illumina Miseq sequencers; assembly of the genome was performed with SPADES software v.3.5.0 and automatic annotation with Rapid Annotation of microbial genomes using Subsystems Technology (RAST) version 4.0. The genotype size was estimated in 4.33 Mb allocated in 18 contigs with C + G content of 60%. The genome automatic annotation identified 3877 coding sequences, 128 tRNAs and 4 rRNA operons in A. trota 1999LCR.Using RAST and the manual search with BLASTP for virulence determinants already described in other species of Aeromonas several genes associated with virulence were identified in the genome of strain 1999LCR. Among them are genes encoding the polar and lateral flagella, what is in agreement with the results of swimming and swarming motility of this bacterium; toxins including AerA (aerolysin), hemolysin III, thermostable hemolysin and cupin-like hemolysin, which may be associated with the previously described hemolytic activity of the bacterium against human erythrocytes. Genes encoding a Type 6 Secretion System (SST6), associated with cytotoxic activities, apoptosis and escape of phagocytosis in other Aeromonas species, have also been identified. Other virulence-associated traits identified include adhesins, the cytotonic enterotoxin Alt, various enzymes previously associated with invasion of host tissues, and an inhibitor of lysozyme from the Ivy family that could protect the bacteria from lytic activity of that enzyme. Therefore, several genes that may participate in the pathogenesis of the bacterium were identified in the genome of A. trota 1999LCR