Regulação pós-traducional da nitrogenase por anaerobiose em Azospirillum brasilense

Orientadora : Profª Drª Emanuel M. de SouzaCoorientador : Prof. Dr. Vivian Rotuno MoureDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 25/05/2017Inclui referências : f. 86-97Resumo: A fixação biológica de nitrogênio é catalisada pelo complexo enzimático nitrogenase. Este complexo contém duas metaloproteínas: as proteínas Fe e MoFe. Em Azospirillum brasilense, objeto deste estudo, a regulação pós-traducional envolve a modificação covalente de uma das subunidades da proteína Fe por ADP-ribosilação. Esta ADPribosilação inativa reversivelmente a proteína Fe e é catalisada pela dinitrogenase redutase ADP-ribosiltransferase (DraT) em resposta ao aumento de íons amônio ou depleção da energia celular. O grupo ADP-ribosil é removido pela dinitrogenase redutase glicohidrolase (DraG), promovendo reativação da proteína Fe e consequentemente, da nitrogenase. Em resposta ao aumento de íons amônio, as proteínas PII, assim como a proteína de membrana AmtB, estão envolvidas no sistema de regulação atuando principalmente por interação direta com proteínas alvo. No caso de A. brasilense, as proteínas PII são denominadas de GlnB e GlnZ e interagem com DraT e DraG, respectivamente, regulando suas atividades. Porém o mecanismo pelo qual estas enzimas são reguladas pelos níveis energéticos celulares não é totalmente conhecido. O objetivo deste trabalho foi contribuir para elucidação do mecanismo da regulação póstraducional da nitrogenase em condições de anaerobiose. Vários aspectos da regulação do metabolismo energético nesta bactéria foram estudados. Para avaliar o envolvimento de AmtB e GlnZ de A. brasilense na regulação da nitrogenase, foi realizado um ensaio de desligamento / religamento da nitrogenase por anaerobiose em mutantes nos respectivos genes. Os resultados mostraram que as proteínas GlnZ e AmtB não participam diretamente da regulação por ADP-ribosilação da nitrogenase. Análises de LC-MS dos níveis de ATP e ADP indicaram redução substancial quando a cultura foi exposta à anaerobiose. Além disso, a adição do desacoplador CCCP, que diminui o ATP intracelular, causou desligamento e ADP-ribosilação da nitrogenase. Portanto, razão ATP/ADP pode estar relacionada ao mecanismo de regulação da atividade da nitrogenase nessas condições. Análise das frações celulares mostrou que, diferentemente da regulação por íons amônio, as proteínas PII não vão para a membrana durante a ADP-ribosilação da nitrogenase. O mesmo ocorre com DraG que permanece no citoplasma. Os resultados sugerem a existência de diferentes vias para o controle da atividade da nitrogenase, que depende do estímulo ao qual as células são submetidas. Palavras-chave: Azospirillum brasilense, regulação pós-traducional, ADP-ribosilação da proteína Fe, sistema DraT/DraG, anaerobiose.Abstract: The biological nitrogen fixation is catalyzed by a nitrogenase enzymatic complex. This complex contains two metalloproteins: the Fe and MoFe proteins and undergoes to post-translational modification. In Azospirillum brasilense, object of this study, this posttranslational regulation involves the covalent modification in one of the subunits of Fe protein by ADP-ribosylation. This ADP-ribosylation reversibly inactivates the Fe protein and is catalyzed by dinitrogenase reductase ADP-ribosyltransferase (DraT) in response to an increase of ammonium concentration or decrease of cellular energy. The ADP-ribosyl group is removed by dinitrogenase reductase glycohydrolase (DraG), promoting Fe protein and, consequently, nitrogenase re-activation. In response to increased ammonium ions, the PII proteins, as well as the NH3 - channel AmtB, are involved in the regulatory system acting primarily by direct interaction with the target proteins. In A. brasilense, the PII proteins are denominated GlnB and GlnZ and interact with DraT and DraG, respectively, regulating DraT and DraG activities. However, the mechanism by which these enzymes are regulated by cellular energy levels is not fully known. The goal of this study was to contribute to the elucidation of the mechanism of post-translational nitrogenase regulation under anaerobic conditions. Several aspects of energy metabolism regulation in this bacterium were studied. To evaluate the involvement of A. brasilense AmtB and GlnZ in the regulation system, switch-off / on assays of nitrogenase by anaerobiosis were performed. The results confirmed that GlnZ and AmtB proteins do not directly participate in ADP- ribosylation of nitrogenase. LC-MS analysis of ATP and ADP levels showed a marked reduction when the culture was exposed to anaerobic conditions. Furthermore, addition of CCCP, which decreases intracellular ATP, caused switch-off and ADP-ribosylation of nitrogenase. Therefore, the ATP / ADP ratio, lead nitrogenase switch-off. Analysis of the cellular fractions, showed that, unlike the regulation by ammonium ions, the PII proteins did not migrate to the membrane during nitrogenase switch-off, and DraG also remained in the cytoplasm. The results suggest distinct pathway for the control of nitrogenase activity depending on which stimulus the cells are submitted to. Key words: Azospirillum brasilense, post-translational regulation, ADP-ribosylation, DraT / DraG system, anaerobiosis