Herpesvirus bovino 4 (BoHV-4) : isolamento e caracterizaação, desenvolvimento de Elisa Indireto para diagnóstico

Orientadora : Profa. Dra. Vanete Thomaz SoccolTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Processos Biotecnológicos. Defesa: Curitiba, 16/01/2012Bibliografia: fls. 77-87Área de concentração: Saúde humana e animalResumo: BoHV-4 é membro da sub-família Gammaherpesvirinae, gênero Rhadinovirus e está associado a diversas manifestações clínicas, em que estudos demonstram uma forte correlação entre infecção por este vírus com metrite pós-parto e aborto em bovinos. Objetivos: este trabalho teve por propósito caracterizar uma amostra viral isolada a partir de secreção uterina de fêmea de bovino e desenvolver técnica de ensaio imunoenzimático - ELISA indireto - para detecção de anticorpos específicos ao BoHV-4 em soros procedentes de treze diferentes estados brasileiros. Material e Métodos: a partir de swabs colhidos de secreção uterina a amostra de vírus isolada foi caracterizada pela citopatologia, morfologia e biologia molecular. Um teste ELISA indireto foi desenvolvido, avaliado e utilizado para pesquisa de anticorpos. Resultados: houve presença de efeito citopático em que a emissão de longos filamentos com pequenos balões ao longo destes foi característica distintiva. Na microscopia eletrônica, a existência de partículas virais com capsídeos com simetria icosaédrica e envelope mostraram-se típicas de Herpesvírus. Na identificação por PCR o produto obtido apresentou 2571 pb, cuja digestão com Hind III gerou fragmentos com 403, 420, 535 e 1125 bp. Do corte do genoma com enzimas de restrição, Hind III e Bam HI, obteve-se as chamadas bandas diagnósticas e a presença de banda hipermolar com 2350 pb, demonstrando ser Herpesvírus bovino-4, pertencente ao grupo DN-599. A padronização da técnica ELISA apresentou resultados diferenciando entre positivo e negativo com os seguintes parâmetros: concentração de antígeno de 5 ?g por poço; diluição de soro 1:25 e diluição do conjugado 1:1600 ou 1:3200. Com a sorologia realizada em bovinos, evidenciou-se a presença de anticorpos em soros procedentes de todos os estados examinados. Conclusão: como já descrito em outros países, em nosso meio o BoHV-4 também está associado a metrite pós-parto, que infecta rebanhos em todos os estados examinados. Em alguns a situação é enzoótica. Metrite pós-parto afeta aproximadamente 40% dos bovinos e a participação deste agente viral como causa de aborto ainda não está incluída nas rotinas de diagnóstico no Brasil. Espera-se com este trabalho despertar a consciência profissional para a participação viral nas enfermidades uterinas de bovinos.Abstract:BoHV-4 is a member of Gammaherpesvirinae sub-family and belongs to genus Rhadinovirus. This virus has been associated to different clinical manifestations and a research activity has put forward an strong correlation among virus infection, postpartum metritis and abortion. Objectives: these works had as major goals to characterize a virus strain isolate from a cow's uterine outflow and the development of an immunoenzimatic assay, indirect ELISA, in order to detect specific antibodies to BoHV-4, in sera harvested from 13 different brazilian states. Material and Methods: from swabs drawn of an uterine secretion a virus strain was isolated and characterized by its cytopathology, morphology and molecular biology aspects. An indirect ELISA was developed, evaluated and utilized to search for BoHV-4 antibodies. Results: there was CPE development, characterized mainly by long strands with several small balloons along them, radiated from infected cells. Electron microscopy analysis revealed virus particles which had icosahedrical capsid symmetry surrounded by a loose envelope, typical of a Herpesvirus. A 2571 bp PCR product, which after Hind III digestion generated four fragments, whose base pair composition were 403,420,535 and 1125 bp. Restriction enzymes Hind III and Bam HI generated the expected diagnostic bands, as well as, a 2350 bp hypermolar fragment, as result of Bam HI treatment, to demonstrate that agent was a bovine Herpesvirus 4, appertaining to DN-599 group. Works done in order to have ELISA methodology under control, such as antigen concentration at ± 5 ?g/well, conjugate dilution 1:1600 or 1:3200 and sera dilution at 1:25, allowed sera categorization as positive, negative or gray zone. Antibodies to BoHV-4 were found in sera from all states screened. Conclusion: as has been described in several countries, in Brazil, also, BoHV-4 is associated to postpartum metritis in cows, and the virus infects herds distributed throughout the states that were under evaluation. Postpartum metritis affects approximately 40% of bovine population, and this viral agent as abortion cause still is not included in Brazil's diagnostic routine. We hope to highlight the participation of viral infections in bovine uterus diseases, in order to get a better professional consciousness