Estudo da regulação da atividade da proteína Nifa de Azospirillum Brasilense

Orientador : Prof. Dr. Emanuel M. de SouzaCoorientadoras : Profa. Dra. Leda S. Chubatsu, Luíza Maria de AraújoDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 15/02/2012Bibliografia: fls. 63-72Resumo: A fixação biológica de nitrogênio é fundamental para disponibilizar este elemento em uma forma que seja metabolicamente utilizável pela maioria dos organismos. Este processo é catalizado pela enzima nitrogenase, que reduz o dinitrogênio gasoso a amônia. A transcrição dos genes envolvidos neste processo é ativada pela proteína NifA, que tem sua atividade controlada pelos níveis de nitrogênio fixado e oxigênio. A proteína NifA é uma proteína ativadora de transcrição da família das EBP, composta por três domínios estruturais. Em A. brasilense, o domínio N-terminal está envolvido na regulação por íons amônio, enquanto um provável grupo Fe-S localizado nos domínios central e C-terminal está envolvido com a sensibilidade ao oxigênio. Para testar a habilidade de uma proteína NifA N-truncada (sem o domínio N-terminal) em ativar a transcrição dos genes nif, nós usamos as estirpes de E. coli YMC10 (estirpe selvagem), RB9060 (glnB-), WCH30 (glnK-) e UNF3435 (glnB- e glnK-), que possuem uma fusão nifH-lacZ cromossomal. A proteína NifA N-truncada de A. brasilense foi capaz de ativar a fusão nifH-lacZ apenas na ausência de oxigênio, confirmando que os domínios central e C-terminal estão envolvidos na regulação por O2. A atividade foi semelhante tanto na presença quanto na ausência de amônio. Houve uma diminuição da atividade da proteína NifA N-truncada de A. brasilense quando esta é co-expressa com seu domínio N-terminal, revelando que esta porção tem a função de controlar negativamente a atividade da proteína NifA na presença de íons amônio. A expressão da proteína NifA N-truncada de A. brasilense e de seu domínio N-terminal foram confirmadas através de imunodetecção. A proteína His-NifA N-truncada foi purificada em anaerobiose e apresentou baixa afinidade pela coluna contendo Ni+2 em ambiente livre de oxigênio. A proteína His-NifA N-truncada purificada apresentou atividade, sendo capaz de se ligar ao promotor do gene nifH de A. brasilense.Abstract: The biological nitrogen fixation is essential to provide the element nitrogen in a form that is metabolically usable by most organisms. This process is catalyzed by the nitrogenase, which reduces dinitrogen to ammonia. The transcription of genes involved in this process is activated by the NifA protein which is controlled by fixed nitrogen and oxygen levels. The NifA protein is a transcriptional activator protein of the EBP family, consisting of three structural domains. In A. brasilense, the N-terminal domain is involved in regulation by ammonium ions, while a putative Fe-S cluster located at the central and C-terminal domain is involved in oxygen sensitivity. To test the ability of an N-truncated NifA protein (without the N-terminal domain) to activate the nif gene transcription, we used the E. coli strains YMC10 (wild type), RB9060 (glnB-), WCH30 (glnK-) and UNF3435 (glnB- and glnK-) carrying a chromosomal nifH-lacZ fusion. The A. brasilense N-truncated NifA protein was able to activate the nifH-lacZ fusion only in the absence of oxygen, confirming that the central domain and C-terminal are involved in O2 regulation. The activity was similar both in the presence or absence of ammonium. There was a decreasing activity when the A. brasilense N-truncated NifA protein was co-expressed with its N-terminal domain, revealing that this portion has the function of negatively controlling NifA activity in the presence of ammonium ions. Expression of the A. brasilense N-truncated NifA protein expression and N-terminal domain were confirmed by immunodetection. The His-N-truncated NifA protein was purified anaerobically and showed low affinity to a Ni+2 bound column in an oxygen-free environment. The purified His-N-truncated NifA protein showed activity, being able to binding to the A. brasilense nifH promoter