Caracterização de estirpes de Aeromonas Spp. E Esherichia Colli através de Espectrometria de Massa Maldi-tof

Orientadora : Profa. Dra. Cyntia M.T. Fadel PichethCo-orientadores : Profa. Dra. Leda S. Chubatsu, Prof. Dr. Luciano HuergoDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 01/03/2012Bibliografia: fls. 59-68Área de concentração: Análises clínicasResumo: Aeromonas spp. são bactérias capazes de causar uma série de infecções em humanos, variando de diarréia não complicada até meningite e septicemia. Escherichia coli fazem parte da microbiota intestinal de humanos, onde são benéficas para o hospedeiro. No entanto existem estirpes patogênicas capazes de causar infecções intestinais, denominadas E. coli diarreiogênicas (DEC), e extra-intestinais (ExPEC) como as E. coli uropatogênicas (UPEC). O objetivo desse trabalho foi caracterizar estirpes de Aeromonas spp. e E. coli através de Espectrometria de Massa MALDI-TOF. Foram analisadas 99 estirpes de Aeromonas spp. e 143 estirpes de E.coli, incluindo comensais isoladas da microbiota intestinal, patotipos, e estirpes de referência. As bactérias foram cultivadas em ágar MacConkey por 18 horas, a 36±1°C, ao ar. O extrato celular preparado a partir de ~10 colônias foi utilizado para análise. O ácido ?-ciano-4-hidroxicinâmico (10 mg/ml) dissolvido em acetonitrila:ácido trifluoroacético 2,5% (1:1) foi utilizado como matriz. Alíquotas dos extratos foram analisadas em espectrômetro de massa MALDI-TOF-MS (Autoflex; Bruker Daltonics) equipado com um laser de nitrogênio (337nm) (Bruker Daltonics). Os íons positivos foram obtidos utilizando uma aceleração de 20Hz no modo linear. Os espectros resultaram da soma dos íons obtidos de 100 tiros do laser em 10 posições diferentes da amostra. A aquisição dos espectros foi realizada de forma manual com uma resolução mínima de 600 arb e máxima de 1500 arb e analisados em uma faixa de relação carga/massa (m/z) de 3.000 a 20.000 Da.O processamento dos espectros foi realizado utilizando o software Flex Analysis v. 3.0 (Bruker Daltonics).Para E. coli os ensaios foram feitos em triplicata, e para Aeromonas spp em triplicata e em duas datas diferentes. Os espectros gerados foram analisados com o software Speclust gerando a lista de picos em comum e um dendrograma. Os picos m/z 4259, 5051, 6304 foram detectados em todas as estirpes de Aeromonas analisadas, o que indica que podem ser marcadores para bactérias deste gênero. O pico m/z 9180 foi observado em Aeromonas spp e E. coli, mas é importante para a identificação de Aeromonas. A espectrometria de massa MALDI-TOF foi capaz de diferenciar as espécies de Aeromonas. Dois picos, m/z 5380 e 7271, foram encontrados em todas as estirpes de E. coli analisadas. Os picos m/z 4364, 5095, 6253, 6314, 9060 e 9532 foram observados em 92 a 99% das E. coli. Estes picos são importantes para identificar E. coli. Foi possível diferenciar o grupo das E. coli comensais e das UPEC das demais categorias dessa bactéria. A metodologia de MALDI-TOF tem capacidade para distinguir as bactérias estudadas, no entanto é necessário otimizar a metodologia para distinguir maior número dos grupos de E. coli.Abstract: Aeromonas spp are bacteria associated with human infections varying from diarrhea to meningitis and septicemia. Escherichia coli are part of intestinal microbiota of humans where are beneficial to host. However there are several pathogenic strains able to cause intestinal infections, called diarrheagenic E. coli (DEC), and extra-intestinal infections (ExPEC), as uropathogenic E. coli (UPEC). The aim of this work was to characterize Aeromonas and E. coli strains using MALDI-TOF Mass Spectrometry. We analyzed 99 Aeromonas strains, and a total of 143 E. coli including commensal, pathotypes and reference strains. Bacteria were grown overnight on MacConkey agar at 36±1°C, under air. Cells extracts were prepares with ~10 colonies. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (10mg/ml) in acetonitrile:2,5% trifluoroacetic acid (1:1) was used as matrix. Aliquots of extracts were analyzed in a MALDI-TOF mass spectrometer (Autoflex, Bruker Daltonics) equipped with a nitrogen laser (337 nm). The positive ions were obtained with a 20 Hz acceleration in linear mode. The spectra were obtained from the sum of 100 laser shots in 10 different positions of sample. Acquisition of spectra was performed manually with a minimum resolution of 600 and maximum of 1500 arb, in a range of 3000 - 20000 Da. Processing of spectra was done with Flex Analysis v.3 (Bruker Daltonics). For E.coli tests were realized in triplicates, and for Aeromonas spp in triplicates and at 2 different days. The spectra were analyzed with software SPECLUST which generated lists of common peaks and a dendrogram. Peaks m/z 4259, 5051, 6304 were found in all Aeromonas strains, indicating that may be markers for the genera. Peak m/z 9180 was found in Aeromonas spp and also in E. coli, but is also important to identification of Aeromonas. MALDI-TOF mass spectrometry allowed to distinguish Aeromonas species. In E. coli, peaks m/z 5380 and 7271 were found in all strains. Peaks m/z 4364, 5095, 6253, 6314, 9060 and 9532 were detected in 92 to 99% of E. coli. All these peaks are important to identify E. coli strains. In addition, commensal E. coli strains and UPEC strains were distinguished from other categories of these bacteria. The MALDI-TOF metodology has the ability to distinguish the bacteria studied, however it should be optimized to achieve this objective