Isolamento de clones com atividade lipolítica do metagenoma de solo contaminado com gordura animal e caracterização de uma nova e eficiente lipase

Resumo: Um gene de uma nova lipase foi identificado a partir de uma biblioteca metagenomica de 500.000 clones construida com a fracao majoritariamente procariotica do DNA de um solo contaminado com gordura animal, proveniente de uma estacao de tratamento de efluentes. Na triagem inicial feita em agar contendo 1% de tributirina, 2661 dos 500.000 clones da biblioteca metagenomica apresentaram atividade. Destes, 127 apresentaram atividade em agar contendo 1% de tricaprilina, enquanto que 32 se mostraram produtores de lipases verdadeiras pela triagem em agar contendo 1% de trioleina. O clone com o maior halo de hidrolise foi caracterizado. O gene da lipase apresentou 72% de identidade com as lipases putativas CBY26912 de Yersinia enterocolitica subsp. palearctica Y11 e YE1842 da Yersinia enterocolitica subsp. Enterocolitica 8081. A lipase, denominada LipC12, apresenta uma cadeia polipeptidica de 293 aminoacidos e massa molecular de 31,2 KDa. A analise da sequencia de LipC12 revelou que ela pertence a familia I.1 das lipases bacterianas e que possui um sitio de ligacao ao ion Ca2+ formado pelos residuos Asp217 e Asp262. Este ion foi essencial para a atividade catalitica. Uma vez que LipC12 apresenta somente uma isteina em sua estrutura (Cys89), ela nao apresenta pontes dissulfeto intramoleculares. Atraves de um modelo tri-dimensional gerado por modelagem molecular, foi possivel identificar o dobramento ƒ¿/ƒÀ das hidrolases, o sitio de ligacao ao calcio e a presenca da tampa hidrofobica (lid) encobrindo o sitio catalitico. Apos clonagem no vetor pET28a(+), a enzima foi superexpressa em E. coli BL21(DE3), purificada por cromatografia de afinidade em coluna de niquel e sua identidade foi confirmada por MALDI-TOF/MS. Analises de estabilidade e atividade lipolitica foram efetuadas atraves dos metodos espectrometricos e itulometricos empregando esteres de p-nitrofenol e triacilglicerois, como substratos, respectivamente. Ensaios de estabilidade termica, dicroismo circular e fluorescencia total demonstraram que o ion calcio exerce acao protetora contra desnaturacao e agregacao da enzima. LipC12 e estavel em concentracoes de ate 3,7M de NaCl e entre 20 e 50 ‹C, com maxima atividade a 30 ‹C em 1 h de incubacao. A enzima purificada tem atividade especifica de 1722 U/mg e 1767 U/mg contra oleo de oliva e gordura de porco, respectivamente. E estavel na faixa de pH de 6 a 11 e tem atividade entre os pHs 4,5 e 10, com elevada atividade em pHs alcalinos. Alem disso, e altamente estavel em solventes organicos nas concentracoes de 15 e 30% (v/v). Essas caracteristicas sugerem que esta lipase tem potencial para ter um bom esempenho em processos biocataliticos, como reacoes de hidrolise e sintese envolvendo triacilglicerois e esteres de acido graxo de cadeia longa