Efeito da Glutationa na oxidação da 2'- Desoxiguanosina pelo oxigênio molecular singlete

Orientadora : Profa. Dra. Glaucia Regina MartinezDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2012Bibliografia: fls. 68-74Resumo: O oxigenio molecular singlete (1O2) e a forma mais reativa do oxigenio molecular e pode ser gerado por diversos processos, inclusive pela decomposicao termica do endoperoxido DHPNO2. Ele e uma especie reativa de oxigenio (ROS) do tipo nao radicalar e possui alta capacidade de danificar todos os tipos de biomoleculas por oxidacao. Dentre as biomoleculas, o DNA merece especial atencao devido ao seu papel crucial na replicacao e, consequentemente, na hereditariedade. Embora outras ROS possam reagir de diferentes formas com as quatro bases do DNA, o 1O2 interage especificamente com a base purica guanina. Isto ocorre em virtude do seu menor potencial de reducao e tambem da energia de seu orbital molecular. O mecanismo de oxidacao do nucleosideo livre 2 f-desoxiguanosina (dGuo) por 1O2 foi extensivamente estudado e foi mostrado que os produtos principais sao os diastereoisomeros da espiroiminodihidantoina (dSp) e a 8-oxodesoxiguanosina (8-oxodGuo). Esta, apos adicao de nova molecula de 1O2, gera um 5-hidroperoxido capaz de formar imidazolona (dIz) ou guanidinodantoina oxidada. A primeira se transforma em oxazolona por hidrolise e a ultima se estabiliza em acido oxalurico na fita de DNA. A glutationa reduzida (GSH) e um tiol de baixo peso molecular de reconhecida capacidade antioxidante. Ela age principalmente como co-fator para a reducao de peroxidos com alteracao simultanea para sua forma dissulfeto, a GSSG. O presente trabalho teve como principal objetivo o estudo da reacao de oxidacao da dGuo por 1O2 e o papel que a adicao de GSH ou GSSG implicaria ao sistema. Os produtos de oxidacao da dGuo foram detectados por cromatografia liquida de alta performance (HPLC). Outra abordagem foi a de oxidar a GSH com DHPNO2 ou H2O2 e depois procurar a geracao de GSSG e acidos sulfinico (GSO2H) e sulfonico (GSO3H) por HPLC acoplado a espectrometria de massas. Os resultados mostraram que a concentracao de DHPNO2 proxima da minima necessaria para gerar produtos de oxidacao da dGuo e de 1 mmol/L. Os produtos de oxidacao detectados foram dSp e, em menor quantidade, 8-oxodGuo. A dIz nao foi encontrada em nenhuma das incubacoes testadas. A adicao de GSH ao sistema pareceu proteger, num primeiro momento, a oxidacao da dGuo, e depois foi bastante eficiente em proteger a oxidacao de 8-oxodGuo a dSp, provocando acumulo de 8-oxodGuo. A GSSG teve pouco ou nenhum efeito sobre o consumo de dGuo e sobre a formacao de 8-oxodGuo, mas alterou a geracao de dSp, principalmente prevenindo-a. O unico produto encontrado apos a oxidacao da GSH por DHPNO2 nas condicoes testadas foi GSSG, enquanto a oxidacao deste tiol por H2O2 favoreceu a formacao de GSSG, GSO2H e GSO3H. Juntos, estes resultados indicam que a GSH amplifica os efeitos danosos da interacao entre dGuo e 1O2 ao provocar o acumulo de 8-oxodGuo, produto altamente mutagenico que pode ser inserido pela DNA polimerase e provocar uma transversao G ¨ T, ou seja, de guanina para timina.Abstract: Singlet molecular oxygen (1O2) is the most reactive form of molecular oxygen and can be generated by several processes, including thermal decomposition of the endoperoxide DHPNO2. It is a non-radicalar reactive oxygen species (ROS) and it is able to damage all kinds of biomolecules through oxidation. Among all biomolecules, DNA deserves special attention due to its decisive role in replication and in heredity. Although other ROS can react in different ways with the four DNA bases, 1O2 interacts specifically with guanine. It occurs due to its lower reduction potential and molecular orbital energy. The mechanisms of oxidation of the free nucleoside 2f-deoxyguanosine (dGuo) by 1O2 have been widely studied and it has been showed that its main products are the diastereoisomers of spiroiminodihydantoin (dSp) and the 8-oxo-7,8-dihydro-2f-deoxyguanosine (8-oxodGuo). This product, after new 1O2 addition, generates a 5-hidroperoxide able to form imidazolone (dIz) or oxidized guanidinohydantoin. The former is transformed in oxazolone by hydrolysis and the latter can stabilize in oxaluric acid in the DNA strand. Reduced glutathione (GSH) is a low molecular weight thiol that has acknowledged antioxidant ability. It acts mainly as a co-factor for peroxides reduction, shifting to its disulfide form GSSG. This work had as main goal to study the dGuo oxidation reaction by 1O2 and the role of GSH or GSSG in the system. All dGuo oxidation products were detected by high performance liquid chromatography (HPLC). Another approach was to oxidize GSH with DHPNO2 or H2O2 and search for GSSG and sulfinic (GSO2H) or sulfonic (GSO3H) acids through HPLC coupled to mass spectrometry. Results show that the DHPNO2 concentration near of the minimal necessary for generating dGuo oxidation products was 1 mmol/L. The oxidizing products detected were dSp and, in less extension, 8-oxodGuo. Imidazolone was not found in any tested incubations. Adding GSH to the system seemed to protect, at first sight, dGuo oxidation. Later, it was very efficient in protecting 8-oxodGuo oxidation to dSp, causing 8-oxodGuo accumulation. GSSG had little or no effect on dGuo consumption and 8-oxodGuo formation, but interfered with dSp generation, mostly preventing it. The single product found after GSH oxidation by DHPNO2 was GSSG, while this thiol oxidation by H2O2 favored the formation of GSSG, GSO2H and GSO3H. Taken together, these results indicate that GSH amplifies the harmful effects of the interaction between dGuo e 1O2 by provoking 8-oxodGuo accumulation. This is especially dangerous because this product is highly mutagenic and can be inserted by the DNA polimerase, causing a G ¨ T transversion, what means an exchange from guanine to thymine