Identificação de uma nova lipase a partir de clones de uma biblioteca metagenômica de solo contaminado com gordura animal

Orientadora : Profª. Drª. Leda Satie ChubatsuCoorientador : Dr. Helisson FaoroCoorientador : Dr. Marco Aurélio Shüler de OliveiraDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 20/03/2015Inclui referências : f. 57-68Resumo: A análise de 192 clones previamente isolados de uma biblioteca metagenômica construída a partir de uma amostra de solo contaminado com gordura animal levou a escolha de 12 clones com atividade lipolítica na presença de tributirina 1%, trioctanoína 1% ou trioleína 1%. Os fosmídeos dos 12 clones selecionados foram purificados e fragmentados com as enzimas de restrição BamHI e EcoRI para comparação, indicando diferentes perfis de restrição entre todos eles. Três clones que apresentaram os maiores halos de hidrólise em meio LB-ágar contendo trioleína 1% e foram escolhidos para identificação da lipase. Os fosmídeos destes três clones foram digeridos com a enzima EcoRI para a construção de sub-bibliotecas metagenômicas em vetor pUC19. Os clones obtidos de cada sub-biblioteca foram submetidos a uma nova triagem nos meios de cultura contendo triacilgliceróis a fim de identificar aqueles com atividade lipolítica. A partir do sequenciamento desses clones foram identificados genes que codificam para uma lipase e sua chaperona. O gene para lipase apresenta 903 pb, codificando para uma proteína de 301 aminoácidos. Um possível peptídeo sinal foi localizado na porção N-terminal da proteína. O gene para a chaperona encontra-se a jusante do gene da lipase, apresentando 741 pb e codificando uma proteína de 247 aminoácidos. Análises mostraram alta similaridade com proteínas não caracterizadas de Aeromonas hidrophyla. Oligonucleotídeos iniciadores foram construídos permitindo a amplificação dos genes isolados neste trabalho. Palavras-chave: Metagenômica, Lipase, Lipase bacterianaAbstract: Analysis of 192 clones previously isolated from a metagenomic library constructed from a soil sample contaminated with animal fat led to selection of 12 clones with lipolytic activity in the presence of 1% tributyrin, 1%trioctanoin, or 1% triolein. The fosmids from the 12 selected clones were purified and fragmented with the restriction enzymes BamHI and EcoRI for comparison, showing different restriction profiles. Three clones that showed the largest hydrolysis halos in LB agar containing 1% triolein were chosen for lipase identification. These fosmids were digested with EcoRI in order to construct sub-metagenomic DNA libraries into the pUC19 vector. Clones obtained from each sub-library were subjected to screening in a new culture medium containing triacylglycerols in order to identify those with lipolytic activity. By sequencing, we have identified genes encoding a lipase and a chaperone were identified. The lipase gene has 903bp, encoding for a protein with 301 amino acid. A putative signal peptide is located at N-terminal portion of this protein. The chaperone gene is located downstream of the lipase gene showing a 741bp encoding for a 247 amino acid protein. Analysis also showed high similarity to uncharacterized proteins of Aeromonas hidrophyla. Oligonucleotide primers were constructed allowing the amplification of the genes isolated in this work which will allow the characterization of these proteins upon over-expression. Key-words: Metagenome, lipase, bacterial lipase