Estratégias de controle e identificação de fungos produtores de ocratoxina A

Orientadora : Profª. Drª. Ida Chapaval PimentelCoorientadora : Profª. Drª. Patricia do Rocio DalzotoTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 26/03/2015Inclui referências : f. 82-107Resumo: A ocratoxina A (OTA) é uma micotoxina encontrada em vários alimentos como, por exemplo, cereais, café, cacau, uva, especiarias, cerveja, vinho, ovos e carnes, sendo produzida por fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillium. O Brasil é o maior produtor e exportador de café, entretanto, a OTA tem sido avaliada com níveis de contaminação variando significativamente no país. Atualmente, muitos países possuem legislações estabelecendo limites máximos de OTA em vários alimentos. Na tentativa de minimizar as concentrações desta micotoxina nos alimentos, são utilizados métodos de controle físicos, químicos ou biológicos. Embora, métodos físicos e químicos de desintoxicação tenham sido testados, nenhum possui realmente a eficácia e segurança necessárias. Dessa forma, recentemente, pesquisas tem relatado a utilização de micro-organismos e extratos de plantas como possíveis controladores da OTA. Neste sentido, os objetivos do presente trabalho foram avaliar fungos isolados de grãos de café na inibição de crescimento e produção de OTA pelos fungos Aspergillus ochraceus, Aspergillus westerdijkiae, Aspergillus niger e Aspergillus carbonarius; avaliar o potencial de extratos de erva mate na inibição de crescimento dos mesmos fungos produtores de OTA; e utilizar a técnica da espectroscopia no infravermelho para a elaboração de um modelo quimiométrico eficiente na identificação das espécies de Aspergillus produtoras de OTA. Os testes de inibição de crescimento foram realizados pela técnica do crescimento radial. Para a quantificação de OTA, três plugs de 6mm do meio de cultivo foram retirados, após o teste de crescimento, e extraídos com metanol, em seguida avaliados por Cromatrografia Líquida de Alta eficiência (CLAE). Para as análises da espectroscopia no infravermelho os fungos foram crescidos por 4 dias a 28±0,5°C, o micélio foi raspado e em seguida os espectros foram capturados no modo transmitância com intervalo espectral de 4000 a 400 cm-1. O modelo quimiométrico desenvolvido com base na espectroscopia no infravermelho foi capaz de distinguir corretamente as espécies altamente relacionadas, tais como A. niger e A. carbonarius. No entanto, a diferenciação de A. ochraceus e A. westerdijkiae não foi possível em todos os casos. Em relação à inibição de crescimento e produção de OTA por fungos, todos os fungos testados foram capazes de inibir tanto o crescimento quanto a produção de OTA. As porcentagens de inibição de crescimento variaram de 18,30% a 100% e porcentagens de inibição da produção de OTA variaram de 43,45% a 100%. A linhagem A. niger C187 não toxigênica, apresentou os melhores resultados para ambos os testes. A utilização de extratos de erva-mate na inibição de crescimento de fungos produtores de OTA, apresentou uma inibição discreta para os fungos A. westerdijkiae e A. ochraceus (0,54% a 13,27%) com extratos nas concentrações de 0,1g/L, 0,5g/L e 10g/L. Para as espécies A. niger e A. carbonarius não foi observado inibição em nenhuma das concentrações e extratos testados. Os fungos isolados de grãos de café apresentaram-se como uma alternativa no controle da OTA em alimentos. Palavras chave: Aspergillus; Espectroscopia no infravermelho; Modelo quimiométrico; Inibição; Ocratoxina A.Abstract: Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin found in several foods, such as cereals, coffee, cocoa, grapes, spices, beer, wine, meat and eggs, being produced by fungi Aspergillus and Penicillium genera. Brazil is the leading producer and exporter of coffee, however, the OTA have been evaluated with levels varying significantly in the country. Currently, many countries have legislation setting maximum limits of OTA in several foods. Control methods are used in order to minimize the concentrations of this mycotoxin in foods, the methods used may be physical, chemical or biological. Although physical and chemical methods of detoxification have been tested, none really has the necessary effectiveness and safety. Thus, recently, studies have reported the use of microorganisms, and plant extracts as possible controllers of OTA. In this regard, the aims of this study were to assess fungi isolated from coffee beans in growth and OTA production inhibition by Aspergillus ochraceus, Aspergillus westerdijkiae, Aspergillus niger and Aspergillus carbonarius; to evaluate the potential of yerba mate extract in inhibiting growth of the same OTA producing fungi; and to use infrared spectroscopy technique for the development of an efficient chemometric model to identify the Aspergillus species producing OTA. Growth inhibition test were performed by the radial growth technique. For the quantification of OTA, three plugs 6mm culture medium were removed after growth test, extracted with methanol and then analyzed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). For the analysis of infrared spectroscopy, fungi were grown for 4 days at 28 ± 0.5°C, the mycelium was then scraped and the spectra were captured in transmittance mode with a spectral range 4000-400 cm-1. The chemometric model developed based on infrared spectroscopy was able to correctly distinguish the highly related species, such as A. niger and A. carbonarius. However, the differentiation of A. ochraceus and A. westerdijkiae was not possible in all cases. With regard, growth and production OTA inhibition by fungi, all the fungi tested were able to inhibit growth and production OTA. The percentage growth inhibition ranged from 18.3% to 100% and the percentage inhibition OTA production ranged from 43.45% to 100%. The strain A. niger C187 non-toxigenic, showed the best results for both tests. The use of yerba mate extracts in growth inhibition of OTA producers fungi has shown a slight inhibition to fungi A. westerdijkiae and A. ochraceus (0.54% to 13.27%) with extracts at concentrations of 0.1g/L, 0.5g/L and 10g/L. For A. niger and A. carbonarius inhibition was not observed in any of the tested concentrations and extracts. The fungi isolated from coffee beans are presented as an alternative to control the OTA food. Keywords: Aspergillus; Infrared Spectroscopy; Chemometric model; Inhibition; Ochratoxin A