Efeitos do plastificante dibutil ftalato (DBP) em modelos in vivo e in vitro de hipersensibilidade de contato

Orientador : Prof. Dr. Anderson Joel Martino AndradeCo-orientador : Prof. Dr. Michel Fleith OtukiTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa: Curitiba, 29/10/2015Inclui referênciasResumo: A prevalência de doenças alérgicas tais como dermatite, asma e rinite, tem aumentado, e isso poderia ser devido à presença de substâncias químicas ambientais com potencial adjuvante, ou seja, capazes de exacerbar a resposta imune. Ésteres de ftalatos, plastificantes amplamente encontrados no ambiente, têm sido reportados como participantes no desenvolvimento de doenças alérgicas agindo como adjuvantes. A hipersensibilidade de contato (HSC) é uma reação alérgica que resulta de contatos repetidos da pele com substâncias químicas chamadas haptenos, e consiste em duas fases: sensibilização e elicitação. O plastificante dibutil ftalato (DBP) é capaz de aumentar a resposta inflamatória em HSC induzida por alérgeno quando associado em ambas as fases da HSC, mas em doses muito mais altas que aquelas potencialmente relevantes para a exposição humana. Além disso, os mecanismos moleculares envolvidos nesse efeito adjuvante não estão completamente elucidados. O presente estudo pretendeu investigar os efeitos do DBP na fase de elicitação da HSC induzida por oxazolona em modelo animal de edema de orelha, usando camundongos BALB/c e doses mais baixas de DBP. Ainda, investigamos alguns aspectos relacionados aos mecanismos envolvidos nesse efeito adjuvante. Para isso, avaliamos os efeitos do DBP isoladamente ou associado a alérgenos em dois ensaios in vitro, o ensaio de ativação de NCTC 2544 (representativo de ativação de queratinócitos) e o ensaio de ativação de THP-1 (substituto de ativação de células dendríticas). Foi também investigado se a indução de estresse oxidativo poderia ser parte do mecanismo molecular responsável pelo efeito adjuvante induzido pelo DBP. Ainda avaliamos a possível participação da ativação dos receptores de potencial transitório A1 e V1 (TRPA1 e TRPV1) no efeito adjuvante do DBP no modelo de HSC induzida por oxazolona. In vivo, os parâmetros avaliados foram edema de orelha, 24, 48 e 72 horas após a elicitação, atividade das enzimas N-acetil-?-d-glucosaminidase (NAG) e mieloperoxidase (MPO) (marcadores de infiltração de leucócitos), análise histológica (contagem de células infiltradas, espessura da derme e epiderme) e dosagem de hidroperóxidos de lipídeos (LOOH) e glutationa reduzida (GSH). Nos experimentos in vitro, a produção de interleucina 18 (IL-18) foi avaliada em células NCTC 2544, e a expressão do cluster de diferenciação 86 (CD86) e mRNA de interleucina 8 (IL-8) além da produção de IL-8 e de espécies reativas de oxigênio (EROs) foram avaliados em células THP-1. In vivo, o DBP, nas duas maiores doses (0,4 e 4 mg/orelha), foi capaz de aumentar a resposta inflamatória envolvida na HSC induzida por oxazolona, como observado por aumento no edema de orelha, hiperplasia dérmica e epidérmica, contagem de células infiltradas e atividade de NAG e MPO. Antagonistas TRPA1 e TRPV1 reverteram parcial ou completamente, respectivamente, o efeito adjuvante do DBP neste modelo animal de HSC, sugerindo que a ativação destes TRPs seja parte do mecanismo molecular envolvido no efeito adjuvante. In vitro, DBP potencializou a ativação de células THP-1, como foi demonstrado pelo aumento da expressão de CD86 e IL-8 mRNA e liberação de IL-8 após exposição a associações de DBP com Citral e imidazolidinil ureia , além do aumento da expressão de CD86 em células THP-1 tratadas com DBP associado a oxazolona. Por outro lado, não foi observado efeito adjuvante nas células NCTC 2544, já que não houve aumento na produção de IL-18 após exposição a p-Fenilenodiamina associado ao DBP, sugerindo que o efeito adjuvante do DBP esteja relacionado com maior ativação de células dendríticas e não de queratinócitos. Nossos resultados indicam que o DBP pode agir como adjuvante imunológico tanto in vivo quanto in vitro, e que esse efeito poderia estar relacionado com uma maior ativação de células dendríticas e que envolva ao menos parcialmente a ativação de TRPA1 e TRPV1. Palavras-chave: dibutil ftalato, hipersensibilidade de contato, efeito adjuvante, queratinócitos, células dendríticas, TRPA1, TRPV1, espécies reativas de oxigênio, estresse oxidativo.Abstract: The prevalence of allergic diseases, such as atopic dermatitis, asthma and rhinitis has been increasing, and this could be related to the presence of environmental chemicals with immune adjuvancy potential, which could exacerbate the immune response. Phthalate esters, plasticizers widely found in the environment, have been reported to participate in the development of allergic diseases acting as adjuvants. Contact hypersensitivity (CHS) is an allergic reaction resulting from repeated contact of the skin with chemicals called haptens and consisting in two phases: sensitization and elicitation. The plasticizer dibutyl phthalate (DBP) has been shown to enhance the inflammatory response in allergen-induced CHS when associated both in sensitization and elicitation phases, but in much higher doses than those potentially relevant for human exposure. Besides, the molecular mechanisms involved in this adjuvant effect are not fully understood. The present study aimed to investigate the effects of DBP in the elicitation phase of oxazolone induced CHS in an animal model of ear edema, using BALB/c mice and lower doses of DBP. Additionally, we intended to investigate some aspects related to the mechanisms involved in this adjuvant effect. For that, we evaluated the effects of DBP alone or in association with allergens in two in vitro assays, NCTC 2544 activation assay (representative of keratinocyte activation) and THP-1 activation assay (surrogate for dendritic cell activation). It was also investigated if the induction of oxidative stress could be part of the molecular mechanisms underlying the adjuvant effect induced by DBP. Moreover, we evaluated the possible participation of transient receptor potential cation channel (TRP) A1 (TRPA1) and V1 (TRPV1) activation by DBP in the animal model of CHS induced by oxazolone. In vivo, the parameters evaluated were ear edema 24, 48 and 72 hours after elicitation, activity of the enzymes N-acetyl-?-d-glucosaminidase (NAG) and myeloperoxidase (MPO) (markers of leukocyte infiltration), histological analysis (infiltrated cell count, dermal and epidermal thickness) and lipid hydroperoxide (LOOH) and reduced glutathione (GSH) levels. For in vitro experiments, interleukin 18 (IL-18) production was assessed in NCTC 2544 cells and the expression of cluster of differentiation 86 (CD86) and interleukin-8 mRNA besides the release of IL-8 and reactive oxygen species (ROS) production were evaluated in THP-1 cells. In vivo, DBP in the two highest doses (0.4 and 4 mg/ear) was able to increase the inflammatory response involved in oxazolone-induced CHS, as observed by increase in ear edema, epidermal and dermal hyperplasia, infiltrated cell count and NAG and MPO activity. TRPA1 and TRPV1 antagonists reversed partially or completely, respectively, the adjuvant effect of DBP in this animal model of CHS, suggesting that the activation of these TRPs are part of the molecular mechanism involved in the adjuvant effect. In vitro, DBP potentiated THP-1 cell activation since there was increased expression of CD86 and IL-8 mRNA besides IL-8 release in THP-1 cells exposed to combinations of citral or imidazolidinyl urea with DBP, and increased upregulation of CD86 expression after exposure to DBP associated with oxazolone. On the contrary, no adjuvant effect was seen in the human keratinocyte cell line NCTC 2544, as indicated by the lack of increase in IL-18 production after exposure to p-Phenylenediamine in association with DBP, suggesting that the adjuvant effect of DBP relies on dendritic cells rather than on keratinocytes. In conclusion, our results indicate that DBP can act as an immune adjuvant both in vivo and in vitro, and this effect could be mainly related to increased dendritic cell activation and at least partially achieved by the activation of TRPA1 and TRPV1. Key words: dibutyl phthalate, contact hypersensitivity,adjuvant effect, keratinocytes, dendritic cells, TRPA1, TRPV1, reactive oxygen species, oxidative stress