Análise comparativa estrutural e das propriedades biológicas das toxinas dermonecróticas recombinantes LiRecDT1, LiRecDT2 e LiRecDT3 do veneno da aranha-marrom (Loxosceles intermedia)

Orientador : Silvio Sanches VeigaCo-orientador : Waldemiro GremskiDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2007Inclui bibliografiaAlgumas espécies de aracnídeos consistem em um problema de saúde pública, sendo o envenenamento por essas espécies de grande importância médica em todo o mundo. O gênero Loxosceles, cujos representantes são conhecidos como aranha-marrom provocam envenenamento caracterizado por lesão dermonecrótica e distúrbios sistêmicos. Levantamentos epidemiológicos realizados relataram um aumento significativo e crescente no número de casos de loxoscelismo em Curitiba e região metropolitana, a partir do ano de 1989. Loxoscelismo é o termo utilizado para descrever lesões e reações em conseqüência do envenenamento por aranhas do gênero Loxosceles sendo o desenvolvimento do quadro clínico e potencial de toxicidade variável em função de inúmeros fatores. Análises estruturais e ultraestruturais da pele de coelhos permitiram a observação da ação do veneno em células endoteliais revelando instabilidade, vasodilatação, degeneração da parede dos vasos sanguíneos e vacuolização do citoplasma das células endoteliais. A presença de uma molécula de 30kDa em extratos renais de camundongos tratados com veneno total também denota o envolvimento das toxinas dermonecróticas na atividade tóxica renal produzida pelo envenenamento por L. intermedia. O presente trabalho teve como objetivo contribuir para o entendimento dos mecanismos biológicos e análise estrutural das toxinas dermonecróticas presentes no veneno de Loxosceles. Os resultados provenientes do ensaio de ELISA corroboraram com os dados de immunoblotting e demonstraram reatividade cruzada entre as toxinas dermonecróticas recombinantes LiRecDT1, LiRecDT2 e LiRecDT3. No ensaio de mortalidade em camundongos, apenas as toxinas LiRecDT1 e LiRecDT2 provocaram a morte dos animais no período de 24 horas. A indução da formação de edema foi demonstrada através da inoculação de LiRecDT1 e LiRecDT2, provocando efeito edematogênico intenso. A avaliação da citotoxicidade in vitro No ensaio de citotoxicidade houve redução da viabilidade celular para o tratamento com LiRecDT1 e LiRecDT2. No ensaio de morfologia com células de epitélio renal tratadas com LiRecDT1 e LiRecDT2 mostraram vacuolização citoplasmática e disfunção no espalhamento das. Os resultados obtidos através de dicroísmo circular revelaram para LiRecDT3 um aumento significativo no conteúdo de alfa-hélice e decréscimo no conteúdo de folha-ß em comparação com os valores referentes à LiRecDT1 e LiRecDT2. A atividade hemolítica de LiRecDT1 e LiRecDT2 foi de 33%. Os resultados apresentados evidenciam as diferenças estruturais entre LiRecDT1, LiRecDT2 e LiRecDT3, e consequentemente nas atividades biológicas observadas para estas toxinas, envolvidas no envenenamento por Loxosceles.Some species of arachnids consist on a public health problem, being the envenomation by these species of great medical importance in whole world. Loxosceles genus whose animals are known as brown spider cause envenomation characterized as dermonecrotic lesions and systemic manifestations. Epidemiological surveys accomplished have mentioned a significant increase in the number of cases of loxoscelism in Curitiba and neighbourhood since 1989. Loxoscelism is the term used to describe lesions and reactions due to envenomation by spiders of Loxosceles genus, being the progress of clinical state and potencial of toxicity variable in regard to several factors. Structural and ultra-structural analysis of rabbit skin allow the observation of the toxic effect upon endothelial cells displaying blood vessel instability, vasodilatation, degeneration of the blood vessel wall and endothelial cell vacuolisation. The presence of a 30kDa molecule on renal lysates of mouse treated with crude venom was an indicative of dermonecrotic toxin involvement in renal injuries caused by L. intermedia envenomation. The aim of this study was to contribute for the knowledge of biological mechanisms and the structural analysis of dermonecrotic toxins of brown spider venom. ELISA assays results corroborated with the immunoblotting data and showed cross-reactivity among recombinant dermonecrotic toxins LiRecDT1, LiRecDT2 and LiRecDT3. On the mortality assay, only LiRecDT1 and LiRecDT2 induced the death of the animals after 24 hours. Induction of edema was displayed through LiRecDT1 and LiRecDT2 administration, causing intense edematogenic effect. In vitro cytotoxicity evaluation demonstrated reduction of cell viability for LiRecDT1 and LiRecDT2 treatment. Experiments on morphology using renal epithelial cells exposed to LiRecDT1 and LiRecDT2 showed cytoplasmic vacuoles and impaired spreading from culture substratum. Results of circular dichroism demonstrated for LiRecDT3 a significative increase of alfa-helix content and a decrease of ß-sheet content in comparison with LiRecDT1 and LiRecDT2. The hemolytic activity of LiRecDT1 and LiRecDT2 was 33%. The present results evidence structural differences among LiRecDT1, LiRecDT2 and LiRecDT3 and consequently different biological activities observed for these toxins, involved in Loxosceles spider envenomation