Potencial de fertilização in vitro e in vivo de espermatozoides bovinos criopreservados de epidídimos mantidos até 30 horas em temperatura ambiente (18-20ºC)

Orientador : Prof. Dr. Romildo Romualdo WeissTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 03/03/2016Inclui referências : fÁrea de concentração: Biotecnologia agroalimentarResumo: Os objetivos desse estudo foram: comparar as dimensões do epidídimo, a biometria testicular e a viabilidade dos espermatozoides recuperados da cauda de epidídimos direitos e esquerdos de touros zebuínos, determinar a eficácia de dois diluentes comerciais na criopreservação e avaliar a capacidade de fertilização dos espermatozoides do epidídimo, na produção in vitro de embriões (PIVE) e na inseminação artificial em tempo fixo (IATF). Após orquiectomia de dez touros da raça Tabapuã, as dimensões e peso testiculares foram aferidos e os espermatozoides recuperados por fluxo retrógrado após permanecerem 6, 12, 18, 24 e 30 horas na cauda dos epidídimos (n=20) em 19 ± 1°C. Em seguida, foram avaliados os seguintes parâmetros espermáticos: motilidade, vigor, concentração e morfologia, e os resultados comparados entre os obtidos dos epidídimos direitos e esquerdos. Para criopreservação utilizou-se dois diluentes comerciais: Botubov® (BB) e Bovimix® (BV). Os parâmetros espermáticos pós-descongelamento foram determinados no CASA (computer-assisted sperm analysis) e por análises microscópicas (integridade de membranas plasmáticas e acrossomal e morfologia). Doses de espermatozoides do epidídimo (G6, G12, G18, G24 e G30), e do ejaculado criopreservadas com o diluente BB, foram utilizadas na fertilização in vitro (FIV) de oócitos obtidos em abatedouro. O cultivo in vitro (CIV) dos embriões manteve-se por oito dias e a taxa de clivagem (dia três), a taxa de blastocistos (dia sete e oito) e a taxa de eclosão (dia oito) foram determinadas para cada grupo. O número total de células embrionárias foi definido. Dez doses criopreservadas do grupo que permaneceu mais tempo na cauda do epidídimo após orquiectomia (G30) foram utilizadas na inseminação artificial em tempo fixo de dez novilhas da raça Tabapuã. Os softwares JMP v.15 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA) e o Statgraphics® Centurion XVI foram utilizados para estatística. Utilizou-se nível de significância (p0,05). Em todos os grupos foi possível produzir embriões viáveis in vitro. O número de blastocistos, e a taxa de eclosão são menores conforme aumenta o tempo de exposição à temperatura ambiente dos espermatozoides na cauda do epidídimo. Quando testados in vivo, os espermatozoides do G30, com apenas 5,2% de motilidade progressiva, estavam aptos a fecundar, obtendo-se o resultado satisfatório de uma prenhez. Conclui-se que, os dois testículos e epidídimos são semelhantes em morfologia e características espermáticas, BB e BV podem ser utilizados na criopreservação de espermatozoides do epidídimo e é possível produzir embriões in vitro até o estágio de blastocisto eclodido e uma gestação após IATF a partir de espermatozoides bovinos criopreservados quando recuperados da cauda de epidídimos mantidos em temperatura ambiente de 18 à 20°C, até 30 horas pós-orquiectomia. Palavras-chave: espermatozoides, epidídimo, criopreservação, FIV, IATFAbstract: The aims of this study were: to compare the epididymis dimensions, testis size and viability of recovered spermatozoa from right and left epididymis of Zebu bulls, to determine the efficacy of two commercial extenders in cryopreservation and assess the fertilizing capacity on in vitro embryo production and fixed time artificial insemination (FTAI) of sperm from the epididymis. After orchiectomy of ten Tabapuã bulls, the dimensions and testicular weight were measured. The sperm were recovered by retrograde flow after remaining for 6, 12, 18, 24 and 30 hours at room temperature (19 ± 1°C) on the epididymal tail (n=20). The following sperm parameters were evaluated: motility, vigor, concentration and morphology, and the results compared between right and left testicle. For cryopreservation, two commercial extenders were used: Botubov® (BB) and Bovimix® (BV). The post-thaw sperm parameters were determined with CASA (computer-assisted sperm analysis) and microscopic analyzes for assessing the integrity of cell and acrosomal membranes, and sperm morphology. Cryopreserved doses (G6, G12, G18, G24 e G30) with BB diluent, from the epididymis and electroejaculation of the same bulls, have been used in vitro fertilization (IVF) of oocytes obtained from a slaughterhouse. After fertilization, the in vitro culture (IVC) of the embryos was maintained for eight days. The cleavage rate (day three), blastocyst rate (day seven and eight) and hatching rate (day eight) were determined for each group. The total number of cells of embryos has been set. Ten doses of cryopreserved sperm from the group that remained more time in the epididymal tail after orchiectomy (G30) were used in fixed time artificial insemination of ten Tabapuã heifers. The software JMP v.15 and the Statgraphics® Centurion XVI were used for statistical analysis. For all analyzes, significance level was (P0.05). In all groups it was possible to produce viable embryos in vitro. The number of blastocyst and hatching rates are lower with increasing time of exposure of the spermatozoa to room temperature. When tested in vivo, the sperm of G30, with only 5.2% of progressive motility, were able to fertilize, resulting in one successful pregnancy. In conclusion both testicles and epididymides are similar in morphology and sperm characteristics, BB and BV may be used for cryopreservation of epididymal bull sperm and it is possible to produce embryos (blastocyst) in vitro and a pregnancy after FTAI from cryopreserved bull spermatozoa after recovery from the tail of epididymis kept at room temperature of 18 to 20°C until 30 hours. Keywords: spermatozoa, epididymis, cryopreservation, IVF, FTA