Análise do padrão de decaimento do Transcriptoma de Trypanosoma Cruzi

Orientador: Prof. Dr. Christian Macagnan ProbstDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 28/02/2011Bibliografia: fls. 80-93Resumo: O protozoario Trypanosoma cruzi controla sua expressao genica principalmente por mecanismos pos-transcricionais como, por exemplo, a estabilidade de mRNAs. Em trabalho anterior, foram realizados experimentos de microarranjos, para avaliar o decaimento de mRNA de epimastigotas de T. cruzi Dm28c, tratados por 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 e 240 minutos com 10 ƒÊg/mL e 50 ƒÊg/mL de actinomicina D (pontos em replicata, totalizando 40 amostras). Comparando-se os pontos temporais extremos, observou-se de 2 a 3 mil genes diferencialmente expressos para estabilidade de mRNA. Devido as limitacoes inerentes a tecnica de microarranjos, e a possibilidade de se utilizar sequenciamento de DNA como abordagem, a qual possui diversas vantagens em relacao aos microarranjos, foi idealizado o presente trabalho, que foi replanejado de acordo com as informacoes colhidas no trabalho citado acima. Foram analisados pontos temporais de decaimento menores (0, 5, 10, 15, 20 e 25 minutos) com a tecnica de sequenciamento RNA-Seq WT. As vantagens em relacao aos microarranjos sao: medida absoluta (quantitativa), maiores alcance dinamico, resolucao e cobertura genomica, sem hibridizacao cruzada e com pouco ruido de fundo. A dose efetiva do inibidor actinomicina foi fixada em 10 ƒÊg / mL / 107 celulas e foi acrescido sinefungina a 1 ƒÊg / mL / 107 celulas para as analises de decaimento dos mRNAs de T. cruzi. Em conjunto, nossos dados mostram que uma pequena parte da regulacao da expressao genica desse parasito durante o seu ciclo de vida pode ser explicada pela estabilidade de suas moleculas de mRNA. Ja que, foi possivel relacionar a velocidade de decaimento dos transcritos maduros com grupos funcionais envolvidos com montagem e manutencao do citoesqueleto, de ribossomos e de utros tipos de complexos ribonucleoproteicos.Abstract: The protozoan Trypanosoma cruzi controls its gene expression mainly by post-transcriptional mechanisms such as mRNA stability. In a previous work, microarray experiments were prepared to evaluate the mRNA decay in T. cruzi Dm28c epimastigotes, treated for 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 and 240 minutes with 10 ìg/mL and 50 ìg/mL of actinomycin D. Each experimental unity was made in replicate, totalizing 40 samples. Comparing the extreme time points, 2 to 3 thousand differentially expressed genes were identified, concerning molecule stability. This data are a rich repository for mRNA decay analysis, however, the need to hybridize nucleic acid targets and probes, as well as the relative characteristic of the measure and the dependency of signal/background noise ratio produce less conclusive results. In this way, the present project covers earlier (0, 5, 10, 15, 20 and 25 minutes) mRNA decay time points and utilizes the RNA-Seq WT sequencing technique. Among the advantages of RNA-Seq, the measure is quantitative (absolute instead of relative) with better resolution and probe-independent, which confers wider genomic coverage, no cross-hybridization and smaller background noise. Taken together our experiments show that the differentially expressed genes during T. cruzi’s life cycle in epimastigote forms can be partially explained by mRNA decay rates. Moreover, it is possible to correlate mature transcript decay rates with some gene functions resembling cytoskeleton and organelle organization. Mainly genes related with macromolecular complexes such as ribosomes and ribonucleoproteins