Perfis genéticos e resistência a antimicrobianos de estirpes de escherichia coli diarreogênicas e salmonella spp isoladas no Estado do Paraná

Orientadora : Profª. Drª. Cyntia M. T. Fadel PichethTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 17/06/2016Inclui referências : f. 73-91Área de concentração: Análises clínicasResumo: As doenças diarreicas são um problema de saúde pública e uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Salmonella e Escherichia coli diarreogênicas (DEC) estão entre as principais causas de diarreia. Os objetivos deste trabalho foram caracterizar geneticamente e determinar o perfil de resistência aos antimicrobianos de estirpes de Salmonella e DEC isoladas no estado do Paraná. As amostras foram isoladas de culturas de fezes de pacientes envolvidos em surtos ou casos esporádicos de diarreia, sendo composta por 46 estirpes de Salmonella identificadas bioquimicamente e 66 estirpes de DEC incluindo 38 E. coli enteropatogênicas atípicas (aEPEC), 19 E. coli enteroagregativas (EAEC), 4 E. coli produtoras de toxina Shiga (STEC), 3 E. coli de aderência difusa (DAEC), 1 E. coli enteropatogênica (tEPEC) e 1 E. coli enteroinvasora (EIEC) previamente caracterizadas através de PCR. As estirpes de Salmonella foram analisadas por PCR para a identificação do gênero e sorotipagem molecular. A subtipagem foi realizada através da eletroforese em campo pulsado (PFGE) e amplificação de múltiplos loci de fagos (MAPLT). As DEC foram analisadas utilizando PFGE, PCRMultiplex para a determinação do grupo filogenético e quanto à presença de 10 genes adicionais de virulência. O perfil de resistência aos antimicrobianos foi determinado pelo método de disco-difusão. As 46 estirpes de Salmonella foram molecularmente confirmadas quanto ao gênero e classificadas nos sorotipos Enteritidis (33 estirpes) ou Typhimurium (13 estirpes). A PFGE revelou um elevado coeficiente de similaridade (94,6%) entre Salmonella Enteritidis, e o perfil denominado PA/P1 foi compartilhado por 27 (81,8%) dessas estirpes. Duas estirpes de Salmonella Typhimurium foram não tipáveis por PFGE. As 11 restantes produziram 8 perfis de PFGE e 3 de MAPLT, indicando maior diversidade entre as bactérias deste sorotipo. Resistência a um ou mais antimicrobianos foi observada em 42 (91,3%) das estirpes, sendo resistência ao ácido nalidíxico a mais comum (39 estirpes, 84,8%). Os resultados indicam que Salmonella Enteritidis é o sorotipo predominante no estado do Paraná, e o perfil PA/P1/MI/R1 o mais frequentemente associado com casos esporádicos de diarreia e envolvido com 7 de 9 surtos notificados. O poder discriminatório do MAPLT foi menor que da PFGE. Entre os isolados de E. coli uma estirpe de EAEC foi não tipável por PFGE e 59 perfis distintos foram observados entre as 65 DEC remanescentes. Apenas 2 perfis de PFGE foram compartilhados entre aEPEC e 2 entre EAEC. Quanto à filogenia 23 (34,8%) estirpes foram classificadas no grupo B2, 19 (28,8%) no grupo A, 14 (21,2%) no grupo D e 10 (15,2%) no grupo B1. A presença de um ou mais genes adicionais de virulência foi detectada em 57 (86,4%) DEC sendo astA (47%), que codifica a toxina termoestável de EAEC1, e a adesina iha (34,8%) os mais frequentes. O gene codificador da citotoxina subtilase (subAB) não foi detectado em nenhuma das estirpes. Resistência a um ou mais antimicrobianos foi observada entre 45 (68,2%) estirpes sendo a resistência à ampicilina a mais frequente (51,5%) e 14 estirpes apresentaram multirresistência. Este trabalho traz informações importantes para a epidemiologia das doenças diarreicas na região. Palavras-chaves: Tipagem molecular, Salmonella, Escherichia coli diarreogênicas, PFGE, Filogenia.Abstract: Diarrheal diseases are a major public health problem and a major cause of morbidity and mortality worldwide. Salmonella and diarrheagenic Escherichia coli (DEC) are among the main causes of diarrhea. The objectives of this study were to characterize genetically and determine the resistance profile to antimicrobials of Salmonella and DEC isolated in Paraná state. The samples were isolated from stool cultures of patients involved in outbreaks and sporadic cases of diarrhea, consisting of 46 Salmonella strains identified biochemically, and 66 strains DEC including 38 atypical enteropathogenic E. coli (aEPEC), 19 enteroaggregative E. coli (EAEC), 4 E. coli Shiga toxin producing (STEC), 3 diffuse adherence E. coli (DAEC), 1 enteropathogenic E. coli (tEPEC) and 1 enteroinvasive E. coli (EIEC) previously characterized by PCR. Salmonella strains were analyzed by PCR to identify the genus and for molecular serotyping. Subtyping was performed by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and multiple amplification of phage loci typing (MAPLT). DEC were analyzed using PFGE, PCR-Multiplex for determining the phylogenetic group, and for the presence of 10 additional virulence genes. The antimicrobial resistance profile was determined by disk diffusion method. The 46 strains of Salmonella were molecularly confirmed regarding the genus and classified in serotypes Enteritidis (33 strains) or Typhimurium (13 strains). PFGE revealed a high similarity coefficient (94.6%) among Salmonella Enteritidis, and the pattern PA / P1 was shared by 27 (81.8%) of these strains. Two Salmonella Typhimurium strains were non-typeable by PFGE. The remaining 11 produced 8 PFGE pattern and 3 MAPLT, indicating greater diversity among bacteria of this serotype. Resistance to one or more antimicrobials was observed in 42 (91.3%) of the strains, with resistance to nalidixic acid being the most common (39 strains, 84.8%). Results indicate that Salmonella Enteritidis is the serotype predominant in Paraná state, and the profile PA / P1 / M1 was the most often associated with sporadic cases of diarrhea and involved in 7 of 9 reported outbreaks. The discriminatory power of MAPLT was lower than the PFGE. Among E. coli isolates, 1 EAEC strain was not typeable by PFGE and 59 different profiles were observed among the 65 DEC remaining. Only 2 PFGE profiles were shared between aEPEC and 2 between EAEC. In regard to phylogeny, 23 (34.8%) strains were classified as B2, 19 (28.8%) in group A, 14 (21.2%) in group D and 10 (15.2%) in group B1. The presence of one or more additional virulence genes was detected in 57 (86.4%) DEC; astA (47%) encoding the heat-stable toxin EAEC1 and iha adhesin (34.8%) were more frequent. The gene encoding the subtilase cytotoxin (subAB) was not detected in any of the strains. Resistance to one or more antibiotics was observed in 45 (68.2%) strains, ampicillin resistance was the most common (51.5%); 14 strains showed multidrug resistance. This study provides important information for the epidemiology of diarrheal diseases in the region. Keywords: molecular typing, Salmonella, diarrheagenic Escherichia coli, PFGE, phylogeny