Proteômica da glândula salivar de Aedes (Stegomyia) aegypti infectado com DENV-2 e 3

Orientadora : Profª Drª Magda Clara Vieira Costa-RibeiroCo-orientadora : Profª Drª Márcia Gonçalves de CastroDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 30/03/2015Inclui referências : f. 48-56Área de concentraçãoResumo: O mosquito Aedes (Stegomyia) aegypti é o principal vetor de importantes arboviroses, dentre elas a dengue, que acomete aproximadamente 390 milhões de pessoas por ano. Dentro da dinâmica da doença envolvendo a tríade mosquito- vírus-humano, estudos têm procurado explicar a relação existente entre o vírus e o vetor a fim de esclarecer os fatores associados à disseminação dos sorotipos virais, e as suas implicações na epidemiologia da doença. Ainda, no que concerne a transmissão do vírus, as glândulas salivares de Ae. aegypti é um órgão chave na disseminação viral, revestindo-se de grande interesse nos estudos de proteômica. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de proteínas da glândula salivar de fêmeas de Ae. aegypti infectadas com DENV-2 e 3 por meio da proteômica. Fêmeas de Ae. aegypti da cepa Paea foram submetidas ao repasto sanguíneo segundo três grupos de infecção: i) DENV-2, ii) DENV-3, iii) controle. Após 15 dias do repasto sanguíneo procedeu-se a extração da glândula salivar para realização das análises de proteômica, e a separação do corpo das fêmeas para detecção viral por meio da técnica de RT-PCR seguida da nested-PCR. Para as análises de proteômica, pools das glândulas salivares foram analisados por espectrometria de massa, associada à cromatografia líquida, com posterior análises nos programas MaxQuant e Perseus. O percentual de infecção das glândulas salivares utlizadas foi verificado a partir dos dados advindos da RT-PCR seguida da nested-PCR. Os grupos de infecção foram comparados dois a dois usando um Two samples test, através do teste-t. O percentual de infecção encontrado foi de 35% para os grupos de infecção (i) e de 45% para o grupo (ii). Após análise de todos os grupos glândulas salivares (i, ii e iii), obteve-se um total de 1588 proteínas identificadas. Pelo teste-t segundo p-valor (p<0,01) verificouse a expressão de 233 proteínas, ao passo que após teste de Benjamini-Hochberg este número reduziu para 85 proteínas diferencialmente expressas. Após as comparações, 85 proteínas apresentaram nível de expressão diferenciada sendo que dessas, 20 já foram descritas em estudos prévios. Foram identificadas proteínas do metabolismo celular, de funções digestivas, de repasto sanguíneo e da resposta imune do vetor. As proteínas foram classificadas segundo cinco categorias funcionais, sendo que aproximadamente 51% foram classificadas como proteínas do metabolismo básico. Ainda, 35% das proteínas encontradas não foram correlacionadas a nenhuma função. A análise de proteômica da glândula salivar permitiu a identificação de proteínas já descritas na literatura, bem como o encontro de novas proteínas que servirão de base para futuros estudos quanto a sua funcionalidade. Palavras-chave: Aedes (Stegomyia) aegypti. DENV. Biologia molecular. Proteômica. Glândula salivarAbstract: The Aedes (Stegomyia) aegypti mosquito is the main vector of important arboviruses, among them dengue fever, which affects approximately 390 million people per year. Within the dynamics of disease involving the mosquito-virus-human triad studies have tried to explain the relationship between the virus and the vector in order to clarify the factors associated with the spread of the serotypes, and their implications for the epidemiology of the disease. Also, regarding the transmission of the virus, the salivary gland of Ae. aegypti is a key organ in the viral spread becoming of great interest in proteomics studies. The objective of this study was to evaluate the expression of proteins of the salivary gland of Ae. aegypti infected with DENV-2 and 3 by means of proteomics. Ae. aegypti females, Paea strain, were blood feed according to three groups: i) DENV-2, ii) DENV-3, iii) control. After 15 days p.i. the salivary glands were extracted to proteomic analysis, and the body of the females were separated to perform virus detection by RT-PCR followed by a nested PCR. For proteomics analysis, pools of salivary glands were analyzed by mass spectrometry associated with liquid chromatography with subsequent analysis in MaxQuant and Perseus programs. The percentage of infection of the salivary glands used was found from the data arising from RT-PCR followed by nested-PCR. The infected groups were compared using a Two samples test. The percentage of infection was found to be 35% for the group of infection (i) and 45% for the group (ii). Following analysis of all salivary glands groups (i, ii and iii), there was obtained a total of 1588 identified proteins. According to the ttest using a p-value (p