Clonagem e caracterização funcional de anticorpo recombinante Anti-GP35/50 de Trypanosoma cruzi

Orientador : Prof. Dr. Wanderson Duarte da RochaCoorientadora : Profª. Drª. Larissa Magalhães AlvarengaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 14/05/2014Inclui referências : f. 71-82Resumo: A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, é uma doença parasitária que afeta em torno de 12 a 14 milhões de indivíduos, causando um importante impacto econômico. Uma vez que as formas de tratamento disponíveis apresentam eficiência questionáveis e sérios efeitos colaterais, a busca de formas alternativas à terapêutica atual se faz necessária. A melhoria na "entrega" de fármacos pode ser uma estratégia interessante para redução dos efeitos colaterais dos tratamentos utilizados. Além disso, os fármacos ideais são aqueles que interferem em mecanismos específicos do parasito, que são essenciais para sua sobrevivência no hospedeiro mamífero. Nesse sentido, foi demostrado previamente que as mucinas denominadas gp35/50 participam no processo de adesão e invasão celular possibilitando o estabelecimento da infecção, tornando-se candidatos interessantes para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas no tratamento desta parasitose. Adicionalmente, anticorpos monoclonais anti-gp35/50 (mAb-10D8) são capazes de interferir com o mecanismo de virulência de formas tripomastigotas metacíclicas. Conciliando todas as características, decidimos obter anticorpo recombinante anti-gp35/50 (scFv-10D8) para fins terapêuticos, uma vez que estas moléculas são específicas e tem sido utilizadas com sucesso em outras patologias. Desta forma, a tecnologia de anticorpos recombinantes a partir RNA total de hibridoma (mAb-10D8) foi utilizada aqui para obtenção das regiões variáveis das cadeias leves e pesada de mAb-10D8 por RT-PCR utilizando iniciadores específicos. Os fragmentos obtidos foram sequenciados e utilizados para síntese de um gene sintético de scFv (scFv-10D8) otimizado para expressão em E. coli. O gene de scFv-10D8 foi subclonado em vetor de expressão procariótico fusionado à cauda de histidinas (pET22b). Após otimização das condições de indução e enriquecimento de uma fração contendo scFv-10D8, foi demonstrado que a proteína recombinante é capaz de reconhecer as mesmas proteínas identificadas pelo mAb-10D8. Diante destes resultados, especula-se que esse anticorpo recombinante anti-gp35/50 de T. cruzi manterá as mesmas propriedades descritas para o mAb-10D8 e seu fragmento Fab na redução da virulência. Sendo assim, é provável que o scFv-10D8 poderá ser utilizado sozinho ou associado a outras moléculas tóxicas ao parasito. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, scFv-10D8, gp35/50, anticorpos recombinantes.Abstract: Chagas disease is a parasitic disease caused by Trypanosoma cruzi, and affects approximately 10 million individuals causing a major economic impact. Since the available therapeutic approaches have questionable effectiveness and serious side effects, the search for alternatives to the current therapeutic strategies is required. The improvement on drug delivery can reduce the side effects caused by the treatment. Moreover, the ideal drugs are the ones that interfere with specific mechanisms from the parasite that is essential for its survival in the mammalian host. Thus, it was previously shown that the mucins called gp35/50 are involved in cell adhesion and invasion processes enabling the establishment of infection and become interesting candidates for the development of new chemotherapeutic agents. Additionally, it was published that anti-gp35/50 monoclonal antibodies (mAb-10D8) are capable of interfering with the virulence mechanisms of trypomastigotes. Combining all the features we decided to obtain anti-gp35/50 recombinant antibody (scFv-10D8) for therapeutic purposes, since these molecules are specific and have been successfully used in other pathologies. Here, the technology of recombinant antibodies was used to obtain the regions encoding the variable light and heavy chains of mAb-10D8 by RT-PCR using specific primers and total RNA from hybridoma cells. The fragments were sequenced and used for the synthesis of a synthetic gene of scFv (scFv- 10D8) optimized for E. coli expression. The scFv-10D8 gene was subcloned fused to a histidine tag into a prokaryotic expression system (pET22b). After testing some induction conditions and enriching a fraction containing scFv-10D8, it was demonstrated that the recombinant antibody is able to recognize in the same fashion as mAb-10D8 the parasite protein. These results encourage us to speculate that this scFv anti-T.cruzi gp35/50 can be used in a new therapeutic strategy for Chagas disease, since it may retain the features previously described for mAb-10D8 and its Fab fragment. Thus, scFv-10D8 may be used alone or conjugated to a known drug against T. cruzi. Keywords: Trypanosoma cruzi, scFv-10D8, Recombinant antibodies, gp35/5