Caracterização de Salmonella sp. isolada de indústrias de aves baseada na formação de biofilmes, tolerância a sanitizantes e resistência a antimicrobianos

Orientador : Prof. Dr. Luciano dos Santos BersotDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Defesa: Palotina, 10/02/2015Inclui referênciasÁrea de concentração : Saúde animalResumo: A formação de biofilmes por Salmonella sp. é uma preocupação para a indústria de alimentos devido à sua permanência nas superfícies e risco de contaminação constante do produto. Nas salas de corte das indústrias de abate e processamento de aves utilizam-se esteiras condutoras dos produtos, sendo importante caracterizar estirpes de Salmonella isoladas a partir deste local. Neste estudo foi avaliada a correlação da formação de biofilmes em microplacas de poliestireno, polipropileno (PP) e poliuretano (PU) e a presença de genes adrA e csgD relacionados aos componentes formadores da matriz dos biofilmes, celulose e fímbrias, respectivamente. Além disso, foi avaliada a tolerância do biofilme formado no PP e no PU à sanitizantes comumente utilizados na indústria (alcalino clorado, ácido peracético e ambos combinados). Foi avaliada a sensibilidade de Salmonella sp. frente a antimicrobianos e a prevalência de estirpes produtoras de ESBL. As 98 estirpes testadas eram originárias de quatro salas de cortes de plantas processadoras de aves. Foi avaliada a formação de biofilmes em placas de poliestireno após incubação de 108 UFC/mL de cada estirpe em caldo Luria-Bertani por 96h a 35ºC. A formação de biofilmes foi visualizada pela medida da absorbância em leitora de microplacas onde as estirpes foram classificadas em fracamente, moderadamente e fortemente produtoras de biofilmes. Também foi avaliada a formação de biofilmes em slides de 1 cm2 PP e PU, e um slide de cada material com e sem inóculo de Salmonella sp. foi observado ao microscópio eletrônico de varredura. Para a avaliação da eficácia dos sanitizantes após incubação por 96h para a formação do biofilme, foram realizados tratamentos por 5, 10, 15 e 30 minutos. As células viáveis foram removidas logo após o tratamento e após reincubação por mais 96h por meio da agitação em vortex de tubos com solução salina adicionados de esferas de vidro. Uma alíquota foi semeada em ágar TSA para a contagem de micro-organismos formadores de biofilme que ainda permaneceram viáveis e outra foi transferida para uma placa de 96 poços e acrescida de um marcador de viabilidade celular, para posterior observação em leitora de microplacas. Para o teste de suscetibilidade aos antimicrobianos, pelo método de difusão de disco, foram utilizados 18 agentes de 7 classes distintas: ampicilina, cefaclor, ceftiofur, estreptomicina, tobramicina, gentamicina, amicacina, neomicina, enrofloxacina, ácido nalidíxico, ciprofloxacina, florfenicol, sulfa/trimetoprim, tetraciclina, cloranfenicol, meropenem, imipenem e polimixina B. A produção de ESBL foi avaliada pelo método de disco-difusão dupla. A habilidade de formação de biofilmes em poliestireno foi classificada como fortemente somente em uma estirpe. Nas demais estirpes, em 70% a habilidade de formação de biofilmes foi classificada como fracamente e em 29% como moderadamente formadoras de biofilmes. Apesar da alta frequência de estirpes fracamente positivas, ambos os genes pesquisados foram encontrados em todas as estirpes. Foram observadas diferenças de adesão importantes entre o material comumente utilizado para avaliar a habilidade de formação de biofilmes in vitro, o poliestireno, e os materiais utilizados nas superfícies de onde as estirpes foram isoladas, o PP e o PU. Ao microscópio eletrônico de varredura a topografia do PU foi mais rugosa. Em relação ao desafio com sanitizantes, a partir dos slides de PP não foi possível recuperar células viáveis. Quando observado o PU, logo após o tratamento, a redução em relação ao controle positivo foi suficiente para considerar os sanitizantes eficazes. Após a reincubação, para o tratamento com ácido peracético essa diferença foi menor. Das 98 estirpes testadas, 86% mostraram-se multirresistentes e 45% das estirpes mostraram-se produtoras de ESBL pelo método utilizado. Os resultados deste estudo são um alerta para a segurança alimentar. Devido à importância do isolamento de estirpes com capacidade de formar biofilmes tanto no material usualmente testado in vitro quanto nos materiais que compõe as superfícies em matadouros de aves. Fato que pode incorrer em uma persistência desse micro-organismo na indústria e consequente contaminação dos alimentos. Bem como a emergência de estirpes multirresistentes e produtoras de ESBL isoladas em indústrias de abate e processamento de aves. Palavras-chave: Salmonella, biofilmes, eficácia de sanitizantes, multirresistênciaAbstract: Formation of biofilms by Salmonella sp. is a constant concern for the food industry due to their attachment to surfaces and risk of contamination of food products. Cutting rooms in poultry processing and slaughtering plants use conveyor belts in the transport of food products, and it is important that Salmonella strains isolated in these sites are characterized. This study analyzed the correlation between biofilm formation in polystyrene microplates, polypropylene (PP) and polyurethane (PU), and the presence of the genes adrA and csgD, which are related to the formation of biofilm matrices, cellulose and fimbriae, respectively. Tolerance of the biofilm produced in PP and PU against common sanitizers used in the industry (chlorinated alkaline cleaners, peracetic acid, and these two compounds combined) was also evaluated, as well as Salmonella sp. sensitivity to antimicrobials and the prevalence of ESBL-producing strains. The 98 strains that were analyzed came from four cutting rooms in poultry processing plants. Biofilm formation in polystyrene plates was evaluated after incubation of 108 CFU/mL of each strain in Luria-Bertani broth at 35ºC for 96h. Biofilms were assessed by means of absorbance in a microplate reader, and strains were classified as weak, moderate, or strong biofilm-producers. Biofilm formation was also analyzed in 1-cm2 PP and PU slides inoculated or not with Salmonella sp., and analyzed by scanning electron microscopy. Sanitizer efficiency was evaluated after 96-h incubation for biofilm formation. Sanitizer treatments lasted 5, 10, 15 or 30 minutes. Viable cells were removed from the surfaces soon after the treatment, and after reincubation for 96 h, by vortexing tubes with saline solution added of glass beads. One aliquot was cultured in TSA agar to count biofilm-forming microorganisms that still remained viable, and another aliquot was transferred to a plate with 96 wells that was added of cell viability marker and was later on analyzed in the microplate reader. For the antimicrobial susceptibility test using the disk diffusion method, 18 agents of 9 different antimicrobial classes were used: ampicillin, cephachlor, ceftiofur, streptomycin, tobramycin, gentamycin, amikacin, neomycin, enrofloxacin, nalidixic acid, ciprofloxacin, florphenicol, sulfa/trimethoprim, tetracycline, chloramphenicol, meropenem, imipenem, and polymixin B. ESBL production was assessed by the double disk diffusion method. Only one strain was a strong biofilm-producer in polystyrene. For the other strains, ability to produce microfilms was weak in 70% of them, and moderate in 29% of them. In spite of the high frequency of weakly positive strains, both genes were found in all strains. Important differences in adhesion were observed between the material commonly used in the evaluation of in vitro biofilm production – polystyrene – and materials that were used in the surfaces were isolated, PP and PU. Scanning electron microscopy showed that PU had a more irregular surface. No viable cells were recovered in PP slides treated with sanitizers. The reduction in viable cell counts observed in PU soon after sanitizer treatment, compared with the positive control, was enough to consider that sanitizers were efficient. After reincubation, this difference was smaller for the treatment with peracetic acid. From the 98 strains tested, 86% showed to be multiresistant and 45% were ESBL-producers according to the double disk diffusion method. The results of this study are a warning in food safety, due to the importance of the isolation of strains that are able to produce biofilms both on in vitro testing materials and in materials that are used as cutting surfaces in poultry processing plants. These microorganisms could remain in the industry and contaminate food products, and multiresistant and ESBL-producing strains may emerge in the poultry processing and slaughtering industry. Keywords: Salmonella, biofilms, sanitizer efficacy, multiresistanc