Adequação de técnicas moleculares para a detecção de Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 em triatomíneos

Orientadora : Dra. Larissa ReifurCo-orientadora : Dra. Débora do Rocio KlisiowiczDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 11/03/2013Inclui referências : f. 48-55Área de concentração : ParasitologiaResumo: Em 2006, o Brasil recebeu a certificação internacional de eliminação da transmissão da doença de Chagas pelo Triatoma infestans, fornecida pela Organização Pan- Americana da Saúde, tendo o estado da Bahia como o último a receber a certificação. Apesar de o principal vetor ter sido eliminado, outras espécies assumiram o seu lugar e algumas delas apareceram infectadas com Trypanosoma cruzi. Atualmente, a Secretaria de Estado da Saúde da Bahia (SESAB) utiliza apenas o método direto a fresco para o diagnóstico de T. cruzi em conteúdo intestinal de triatomíneos. O método baseia-se na visualização de movimentação sugestiva do protozoário em fezes frescas, portanto, é um teste de baixa sensibilidade. A eficiência da detecção do parasito pode ser melhorada por técnicas moleculares. Neste trabalho foi realizada a adequação de duas técnicas, a amplificação em cadeia da polimerase (PCR) e a amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) para otimizar a detecção de T. cruzi em fezes e urina de triatomíneos do centro norte do estado da Bahia. As otimizações das técnicas de PCR e LAMP possibilitou detectar uma célula de T. cruzi (0,5 fg de DNA) e 1 ng de DNA da amostra controle, respectivamente. Para as amostras teste, 51 triatomíneos da espécie Triatoma brasiliensis e Triatoma pseudomaculata, foram utilizadas para a detecção do DNA de T. cruzi. A técnica de PCR foi capaz de detectar 31,36 % (16/51) de positividade em insetos, sendo mais sensível que o método direto a fresco, onde o mesmo detectou apenas uma amostra, correspondendo a 1,96 % (1/51). O uso de técnicas de detecção mais sensíveis e específicas é importante para apresentar a real situação de triatomíneos infectados por T. cruzi e a partir dos resultados, obter dados epidemiológicos mais acurados sobre a doença de Chagas. A presença de T. cruzi em triatomíneos com potencial transmissão vetorial é um indicativo que o parasito pode estar presente em uma carga parasitária suficiente para manter seu ciclo biológico na região. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, método direto a fresco, PCR, LAMP, triatomíneo.Abstract: In 2006, Brazil received the international certification of elimination of transmission of Chagas disease by Triatoma infestans, provided by the Pan American Health Organization. Bahia was the last Brazilian state to receive this certification. Although the Triatoma infestans has been eliminated from Brazil, other species proliferated and some of them have been found infected with Trypanosoma cruzi. Currently, the Secretaries of State for Health (SSH) adopt the direct fresh method for the diagnosis of T. cruzi in triatomine gut contents. This method is of low sensitivity and specificity as it is based on the visualization of movements suggestive of a tripanosomatid. Considering that parasite detection can be improved by molecular techniques, in this work, the polymerase chain reaction (PCR) and the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) were used to optimize the detection of T. cruzi in feces and urine of triatomines. Using control DNA from an in vitro culture, it was possible to detect 0.5 fg of T. cruzi DNA, by PCR and 1 ng by LAMP. These reaction conditions were then used with DNA samples extracted from triatomines collected in the central north part of Bahia state. Out of the 51 triatomines collected, Triatoma pseudomaculata and Triatoma brasiliensis prevailed. Through PCR, 31,36 % (16/51) of the triatomines were positive for T. cruzi DNA, whereas the direct fresh method detected only one sample possibly positive, corresponding to 1,96 % (1/51). The LAMP technique probably needs more starting DNA in the sample to be able to amplify, thus it will be further optimized. In conclusion, the use of more sensitive and specific techniques is important to show the real situation of T. cruzi infected triatomines in Brazil. The presence of T. cruzi in triatomine species like T. brasiliensis and T. pseudomaculada, which are potential vectors for T. cruzi transmission, is an indication that the parasite may be present in sufficient amounts to maintain their life cycle in Bahia. Keywords: Trypanosoma cruzi, direct fresh method, PCR, LAMP, triatomine