Padronização e avaliação da técnica Real Time PCR como ferramenta de deteccção de Trypanosoma cruzi em amostras de sangue e alimentos

Orientadora : Profa. Dra. Vanete Thomaz SoccolDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 30/01/2015Inclui referências : f.101-137Área de concentração: Saúde humana e animalResumo: A Doença de Chagas é uma enfermidade causada por Trypanosoma cruzi (CHAGAS, 1909) que afeta milhões de pessoas na América Latina. No diagnóstico da doença, testes sorológicos, detecção direta do parasito ou PCR convencional são usados como testes confirmatórios. Porém, estes métodos apresentam restrições quanto à sensibilidade e especificidade. Além disso, microepidemias associadas a alimentos vem demonstrando a importância crescente na via de transmissão oral, a partir do ciclo silvestre. Assim, padronizar metodologias com melhor sensibilidade e especificidade, para detectar o parasito em humanos e em alimentos é necessária. O objetivo desse trabalho foi padronizar a técnica de Real Time PCR para avaliar pacientes chagásicos crônicos e contatos, assim como detectar T. cruzi em alimentos, favorecendo a implantação dessa metodologia em laboratórios, bancos de sangue e como ferramenta no monitoramento do parasito em sangue e alimentos. Para tal, foram desenhados seis iniciadores (Ep1F/Ep1R, Ep2F/Ep2R, Bp1F/Bp1R, Bp2F/Bp2R, Bp3F/Bp3R e Bp4F/Bp4R) usando as sequências das cepas referência de T. cruzi y152 e Esmeraldo obtidas no genebank. Além destes, primers conhecidos e validados pela literatura foram também incluídos a título de comparação (TCZ1/TCZ2 e S35/S36). Para a otimização da técnica (concentração de primers e de DNA e CT de amplificação), foram usadas cepas de T. cruzi, T. rangeli e de Leishmania sp. Após a padronização a melhor especificidade analítica foi observada para o primer Bp1F/Bp1R (detectou apenas T. cruzi). O primer Ep1F/Ep1R permitiu detectar 0,0001 ng/?L do parasito e para TCZ1/TCZ2 a detecção mínima foi de 0,00001 ng/?L de DNA do parasito pela análise da curva padrão. Para validar a metodologia padronizada foram avaliadas 66 amostras de pacientes com doença de Chagas de regiões endêmicas (Paraná, São Paulo, Rio Grande do Sul), 11 amostras de indivíduos com relação de parentesco com os pacientes (contatos), e 30 indivíduos que não possuíam nenhum histórico ou diagnóstico para presença do parasito. Essas amostras foram submetidas à técnica de Real Time PCR aqui padronizada com os primers TCZ1/TCZ2 e Ep1F/Ep1R. A análise da curva ROC usando os primers TCZ1/TCZ2 mostrou uma sensibilidade de 79,2% e especificidade 69,8% (AUC = 69,2%). Para os primers Ep1F/Ep1R a sensibilidade foi 71,7% e especificidade 76,7% (AUC = 77,4%). O teste de McNemar demonstrou que ambos os iniciadores apresentaram maior discordância de resultados com a reação de imunofluorescência (RIFI) em pacientes chagásicos. Em indivíduos contatos o primer Ep1F/Ep1R apresentou maior discordância com a RIFI e ensaio imunoenzimático (ELISA). TCZ1/TCZ2 não apresentou discordância relevante. Ep1F/Ep1R demonstrou maior positividade (72,72%) para esse grupo. Portanto, o primer Ep1F/Ep1R assumiu melhor desempenho quanto à especificidade na determinação de T. cruzi em amostras de sangue que TCZ1/TCZ2. Em amostras de açaí, quando avaliado o açaí in natura (sem tratamento prévio) foi obtido 33% de sensibilidade para cepa de T. cruzi isolada de humanos (HC27) e 76% para a cepa isolada de Panstrongylus megistus (CUR98). Para amostras de açaí autoclavada verificou-se 71% de resultados positivos para ambas as cepas referidas acima. Além disso, em amostras contaminadas artificialmente com T. cruzi (cepa HC27) o limite de detecção foi de 0,75 parasito (p)/mL e com a cepa CUR98 a detecção mínima foi de 0,000019 p/mL. Dentre os primers desenhados Ep1F/Ep1R apresentou bons resultados na determinação de T. cruzi em sangue e açaí, o que encoraja a utilização da técnica de Real Time PCR para o monitoramento de amostras de açaí. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi. Real Time PCR. Sangue. Açaí. Primers. Sensibilidade. Especificidade.Abstract: Chagas disease is caused by Trypanosoma cruzi CHAGAS, 1909, and affects millions of people in Latin America. Diagnostic tests to confirm the disease include indirect tests (antibody in serum), direct detection of the parasite in blood and conventional PCR (DNA detection). However, these methods have limitations because the serological tests detect antibodies and not the parasite, or have low sensitivity (e.g., the parasite is in the internal organs or the chronic phase). In addition, microepidemics associated with foods have shifted the emphasis to the oral route of transmission during the silvatic cycle. Therefore, standardized methodologies with improved sensitivity and specificity are needed to detect the parasite in blood and foods. The aim of this study was to standardize the real-time PCR technique for assessing chronic Chagas patients and contacted individuals, as well as for detecting T. cruzi in foods. To accomplish these objectives, six primers were improved (Ep1F/Ep1R, Ep2F/Ep2R, Bp1F/Bp1R, Bp2F/Bp2R, Bp3F/Bp3R and Bp4F/Bp4R) using the sequences of references strains (T. cruzi y152 and Emerald) obtained from GenBank. Known primers validated in the literature were also included (TCZ1/TCZ2 and S35/S36). Trypanosoma cruzi, T. rangeli and Leishmania sp. strains were employed for optimization (concentration of primers, DNA and CT amplification). The best analytical specificity was observed for the Bp1F/Bp1R primer. The Ep1F/Ep1R primer had minimum detection of 0.0001 ng/?L, while TCZ1/TCZ2 had minimum detection of 0.00001 ng/?L of DNA from the parasite, based on an analysis of the standard curve. To validate the standardized methodology, 66 samples from chronic patients in endemic regions (Paraná, São Paulo and Rio Grande do Sul) were assessed, along with 11 samples from patients' relatives (contacts) and 30 individuals with no history or diagnosis for the presence of the parasite. The samples were submitted to the standardized real-time PCR technique with the TCZ1/TCZ2 and Ep1F/Ep1R primers. On analysis of the ROC curve, Ep1F/Ep1R had 71.7% sensitivity and 76.7% specificity (AUC = 77.4%), while TCZ1/TCZ2 exhibited 79.2% sensitivity and 69.8% specificity (AUC = 69.2%). McNemar's test showed that both primers had greater discordance in their results with the immunofluorescence reaction (IFR) in Chagas patients. Ep1F/Ep1R performed better than the TCZ1/TCZ2 primer, in terms of specificity for the determination of T. cruzi in blood samples. In açaí samples, an assessment of açai in natura (without previous treatment) revealed 33% sensitivity for the T. cruzi when HC27 strain isolated from humans was used and 76% for the CUR98 strain isolated from Panstrongylus megistus. In autoclaved açai samples, 71% positivity was detected for both strains. In addition, for artificially samples infected with HC27 strain, the limit of detection was 0.75 parasites (p)/mL, whereas the minimum detection for the CUR98 strain was 0.000019 p/mL. Ep1F/Ep1R showed good results in determining T. cruzi in blood and açai, favoring the use of the real-time PCR technique for screening blood and açai samples. Key-words: Trypanosoma cruzi. Real Time PCR. Blood. Açaí. Primers. Sensitivity. Specificity