Isolamento e caracterização de bactérias de nódulos de Mimosa spp. da região sul do Brasil

Orientador: Prof. Dr. Leonardo Magalhães CruzCoorientador: Dr. Daniel Renato LammelTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 29/06/2018Inclui referências: p.93-102Resumo: A América do Sul é, possivelmente, o centro de origem do gênero Mimosa com grande ocorrência de espécies endêmicas, devido a sua localização geográfica, variações de terreno e composição do solo. Alguns gêneros de bactérias, conhecidas como rizóbios, colonizam as raízes de Mimosa spp., induzindo a formação de nódulos, onde permanecem alojadas e contribuem para o desenvolvimento da planta através da fixação biológica de nitrogênio. Os rizóbios capazes de nodular plantas do gênero Mimosa pertencem às classes Alfaproteobacteria e Betaproteobacteria, sendo denominadas de alfa-rizóbios e betarizóbios, respectivamente. Na zona Tropical, são isoladas, mais frequentemente, beta-rizóbios do gênero Paraburkholderia, enquanto em zona Subtropical (ex., Uruguai), predomina Cupriavidus. O objetivo deste trabalho foi coletar Mimosa spp. em regiões do Leste do Paraná e Santa Catarina, no Sul do Brasil, e caracterizar as bactérias isoladas dos nódulos, verificando se há uma possível transição de gêneros em relação à latitude terrestre em direção ao Uruguai. Os isolados adquiridos foram identificados através do sequenciamento parcial do gene 16S rRNA e por espectrometria de massa MALDI-TOF, observando-se predominância de betarizóbios do gênero Paraburkholderia. Em uma única amostra foi identificado o gênero Cupriavidus. Em menor número, foram identificados alfa-rizóbios do gênero Rhizobium e, também, bactérias associativas, não capazes de induzir a formação de nódulos, como os gêneros Pseudomonas e Herbaspirillum. A caracterização de isolados dos gêneros Paraburkholderia, Cupriavidus e Rhizobium, abaixo do nível de gênero, foi obtida por análises BOX-PCR e sequenciamento genômico. Estes isolados foram também re-inoculados em plantas de Mimosa pudica (usada como isca), em condições de casa de vegetação, confirmando sua capacidade nodulante. A montagem parcial das sequências genômicas e sua análise confirmou a presença de genes envolvidos na nodulação e fixação biológica de nitrogênio em alguns dos isolados, e permitiu a confirmação das espécies Cupriavidus necator (1 isolado), Paraburkholderia mimosarum (1 isolado) e Paraburkholderia caribensis (2 isolados). Os demais isolados, para os quais foi realizado o sequenciamento genômico, mostraram potencial para constituírem novas espécies de Paraburkholderia sp. (3 isolados), Rhizobium sp. (1 isolado) e Herbaspirillum sp. (1 isolado). Palavras-chave: Mimosa, beta-rizóbios, Paraburkholderia, Cupriavidus, alfa-rizóbios, BOX-PCR, MALDI-TOF MS, genômica.Abstract: South America is, probably, the center of origin of Mimosa genus, within great occurence of endemic species, due to their geographic location, grounds variation and soil composition. Some bacteria genera, known as rhizobia, colonize Mimosa spp. roots, inducing generation of nodules, where they remain logded and contribute tto the plant development by biological nitrogen fixation. Rhizobia that are able to nodulate Mimosa genera plants belong to Alphaproteobacteria and Betaprotebacteria classes, and have been denominated alpha-rhizobia and beta-rhizobia, respectively. In the Tropical zone, it is isolated, more often, beta-rhizobia from Paraburkholderia genus, while in Subtropical zone (for example, Uruguay), predominates Cupriavidus. The main objective of this work was to collect Mimosa spp. in regions of East of Paraná and Santa Catarina states, South of Brazil, and to characterize bacteria isolated from nodules, checking is there were a possible transition between genera in according to terrestrial latitude towards Uruguay. The acquired isolates were identified by partial gene 16S rRNA sequencing and for MALDI-TOF mass spectrometry, observing predominance of beta-rhizobia from Paraburkholderia genus. In only one sample was identified Cupriavidus genus. In less amount, alpharhizobia were identified alpha-rhizobia of Rhizobium genus and associative bacteria, not able to induce nodule generation, as Pseudomonas and Herbaspirillum. The characterization under genus level of Paraburkholderia, Cupriavidus and Rhizobium genera were obtained by BOX-PCR analysis and genomic sequencing. These isolates were reinoculated in Mimosa pudica plantules (used as decoy), in vegetation house conditions, confirming their nodulating capability. The partial assembly of the genomic sequences and their analysis confirmed the presence of genes involved in the nodulation and biological nitrogen fixation in some of the isolates, and allowed to confirm species of Cupriavidus necator (1 isolate), Paraburkholderia mimosarum (1 isolate) and Paraburkholderia caribensis (2 isolates). The other isolates, for which genomic sequencing was carried out, showed the potential to constitute new species of Paraburkholderia sp. (3 isolates), Rhizobium sp. (1 isolate) e Herbaspirillum sp. (1 isolate). Keywords: Mimosa, beta-rhizobia, Paraburkholderia, Cupriavidus, alpha-rhizobia, BOX-PCR, MALDI-TOF MS, genomics