Produçao de ferramentas biológicas e estudo de proteínas dermonecróticas recombinantes de aranha marrom Loxosceles intermedia

Orientador: Silvio Sanches VeigaCo-orientador: Waldemiro GremskiTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 2006Inclui bibliografia e anexosO loxoscelismo, que é o termo usado para determinar o envenenamento por picada de aranha marrom (gênero Loxosceles), tem como característica marcante o aparecimento de lesão dermonecrótica com espalhamento gravitacional e placa marmórea. Dentro os vários componentes que formam o veneno da aranha marrom, uma das moléculas mais estudadas é a esfingomielinase D, responsável pela dermonecrose. Por isso esta enzima em particular tem sido alvo de estudos de biologia molecular com o objetivo de clonagem e expressão. Nosso grupo de pesquisa produziu uma biblioteca de cDNA a partir de glândulas produtoras de veneno de L. intermedia e rastreando vários clones descobriu uma família de esfingomielinases denominadas LiRecDT (Toxina Dermonecrótica Recombinante de Loxosceles intermedia). Neste trabalho foram produzidos anticorpos policlonais em coelho e camundongo com a inoculação da isoforma L1RecDT1 e veneno total. Estes anticorpos foram utilizados para mostrar a reatividade cruzada entre os anticorpos que foram gerados para a LiRecDT1 ou veneno e as outras 4 isoformas clonadas e expressas (LiRecDT2, LiRecDT3, L1RecDT4 e LiRecDT5) e relacionou a reatividade com outros parâmetros como atividade esfingomielinásica, capacidade dermonecrótica e características histológicas da lesão como infiltrado infamatório. A reatividade com os anticorpos foi maior com a LiRecDTI, seguida pela LiRecDT2 e a LiRecDT3 teve a menor reatividade. Estes dados seguiram a mesma proporção para os parâmetros de dermonecrose e atividade esfingomielinásica e infiltrado infamatório. As LiRecDT4 e LiRecDT5 foram também testadas resultando uma reatividade intermediária, onde a LiRecDT4 teve atividade esfingomielinásica e dermonecrótica maior que a LiRecDT5, porém menor que a LiRecDT1 e muito próxima da LiRecDT2. Este trabalho também buscou a clonagem de uma sexta isoforma de proteína dermonecrótica, a LiRecDT6. Esta enzima foi rastreada da mesma biblioteca, contudo se apresentava de forma incompleta faltando uma parte da fração 5'. Para se obter o cDNA completo se realizou uma técnica de 5' RACE usando-se mRNA obtido de extrato de glândula produtora de veneno de L. intermedia. Com o auxílio desta técnica foi possível se obter o cDNA completo e comprovando-se a existência de uma sexta isoforma de esfingomielinase D no veneno de L. intermedia, reforçando dados publicados pelo grupo e da literatura sobre a existência de uma família de proteínas dermonecróticas intra-espécie.Loxoscelism (the condition produced by the bite of brown spiders) has been reported worldwide, but especially in warmer regions. Clinical manifestations include skin necrosis with gravitational spreading while systemic loxoscelism may include renal failure, hemo!ysis and thrombocytopenia. The venom contains several toxins, of which the best biochemicaNy and biologically studied is the dermonecrotic toxin, a sphyngomyelinase. Purified toxin induces cutaneous and systemic loxoscelism, especially necrotic lesions, hematotogical disturbances and renal faNure. Herein, we describe cloning, heterologous expression and purification of two novel isoforms of the dermonecrotic toxin: L,RecDT4 and LiRecDT5. The recombinant proteins stably expressed in Escherichia coli cells were purifled from culture supernatants in a single step using Ni2-chelating chromatography producing soluble proteins of 34kDa (LiRecDT4) and 37kDa (LiRecDT5). Both proteins were recognized by whole venom serum antibodies and by a specific antibody to dermonecrotic toxin. Also, recombinant isoforms with lipase activity induced experimental skin lesions and caused a massive inflammatory response in rabbit skin dermis. Nevertheless, recombinant toxins displayed differential activities of platelet aggregation, increase in vascular permeability as well as not caused death in mice. These characteristics in combination with funttional studies iliustrates that a family of dermonecrotic toxins exists, and includes two novel members that are useful for future structural and functíonal studies. They will also be useful in biotechnological ends, for example, as inflammatory and platetet aggregating studies and antigens for serum therapy source