Desenvolvimento de metodologia quimiométrica e metabolômica para o diagnóstico da hanseníase

Orientador : Prof. Dr. Roberto PontaroloCoorientadora : Profa. Dra. Thais Martins Guimarães de FranciscoDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 10/03/2017Inclui referências: f.93-106Área de concentração: Insumos, medicamentos e correlatosResumo: A hanseníase ainda representa um problema de saúde no Brasil e no mundo. Essa doença, causada pelo Mycobacterium leprae, afeta principalmente a pele e o sistema nervoso periférico. Atualmente sintomas clínicos são utilizados para o diagnóstico desta patologia, no entanto, os sinais inicialmente evidenciados são inespecíficos para um diagnóstico rápido e confiável. Neste trabalho a técnica de Cromatografia Líquida de Ultra Performance acoplada com Espectrômetro de Massas de quadrupolo-tempo de vôo e ionização por electrospray (UPLC-ESI-qTOFMS) foi utilizada como uma ferramenta para a classificação de amostras e possibilidade de detecção da hanseníase. O qTOF trabalha com massas exatas, apresentando maior especificidade em relação a outras técnicas de menor resolução e evitando que se obtenha uma resposta falso-positiva. Além disso, apresenta maior número de informação em uma única análise permitindo uma avaliação mais completa das amostras. Para conclusão dos estudos, foram utilizados plasmas de indivíduos portadores das diferentes formas de hanseníase (Tuberculóide, Virshowiana e Dimorfa; n = 45) bem como de indivíduos sadios (controles, n=15). Previamente às análises, foi realizado o pré-tratamento das amostras com acetonitrila contendo 0,1% de ácido trifluoroacético para a precipitação das proteínas de alto peso molecular. Após a injeção das amostras no UPLC-ESI-qTOF-MS, os dados adquiridos foram analisados por meio de análises quimiométricas. Com o objetivo de identificar padrões de resposta que pudessem diferenciar os grupos em controle e doentes, foram utilizadas análises quimiométricas. A Análise de Componentes Principais (PCA) foi capaz de produzir uma adequada classificação das amostras em grupos com hanseníase e controle (sem hanseníase) e além disso, também contribuiram para indicar as m/z responsáveis pela diferenciação dos grupos, ou seja, possíveis biomarcadores para a doença. As m/z= 756.5551, m/z= 774.5659 e m/z= 790.5606 estavam com a intensidade aumentada nos pacientes com hanseníase e a m/z= 701.5606 estava com a intensidade diminuída neste grupo. A Análise dos Mínimos Quadrados Parciais (PLS) foi utilizada com sucesso para a predição da presença ou ausência da Hanseníase em amostras desconhecidas. O valor do RMSEP foi de 0,032 no grupo Tuberculóide, 0,057 nos Virchowiano, 0,049 no Dimorfo e de 0,11 nos controles. Sendo assim, o método empregado foi considerado sensível, preciso e seletivo em relação a diferenciação das amostras com e sem hanseníase e é apresentado como uma ferramenta para o diagnóstico da mesma, o que possibilita o início do tratamento medicamentoso o mais precocemente possível auxiliando no encerramento do ciclo de transmissão dessa doença. Palavras-chave: Metabolômica 1. Hanseníase 2. UPLC-ESI-qTOF-MS 3.Abstract: Leprosy, also known as Hansen's disease, still represents a health problem in Brazil and in the world. This disease results from infection with Mycobacterium leprae mainly affecting the skin, peripheral nerves, eyes and mucosa of the upper respiratory tract. Diagnosis of leprosy is most commonly based on the clinical signs and symptoms. However, this initially evidenced signs are non-specifics for a rapid and reliable diagnosis. In this work, the classification of samples and the possibility of leprosy detection was investigated using the ultra-performance liquid chromatography coupled to electrospray ionization quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (UPLC-ESI-qTOF-MS) technique and multivariate data analysis (PCA and PLS). To this end, plasma samples of patient with different forms of leprosy (Tuberculoid, Lepromatous and Borderline, n = 45) and healthy individuals (controls, n = 15) were analyzed. Because low molecular weight proteins (LMW), and other small components have been associated with infectious disease, a precipitation method with acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid was used for separation of low molecular weight (LMW) proteins from high abundance and high molecular weight (HMW) proteins in plasma samples. The acetonitrile remaining fractions were analyzed using UPLC-ESI-qTOF-MS. The acquired data were analyzed using multivariate data analysis. Principal component analysis (PCA) provided pattern distinction of control and leprosy plasmas samples and also allowed the visualization of the ions most relevant to group discrimination. Partial Least Squares (PLS) were used successfully to model the data and predict the presence or absence of leprosy in unknown samples (n=18). The method was considered sensitive and selective, once the quadrupole-time-of-flight analyzer (qTOF) detect exact masses, has greater specificity in relation to other techniques of lower resolution avoiding to obtain a false-positive response. In addition, it presents a greater number of information in a single analysis allowing a more complete evaluation of the samples. Therefore, UPLC-ESI-qTOF-MS with multivariate data analysis is a promising technique for diagnosing leprosy patients as soon as possible. Early recognition of leprosy and treatment are key elements to interrupt transmission. Key-words: Metabolomic 1. Leprosy 2. UPLC-ESI-qTOF-MS 3