Regulação da acetil-CoA carboxilase pelas proteínas PII e cristalização da enzima GInD Escherichia coli

Orientador: Dr. Luciano Fernandes HuergoOrientador no exterior: Dr. Liang TongTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 31/01/2018Inclui referências: p.110-125Resumo: As proteínas PII constituem uma das mais amplamente distribuídas famílias de proteínas transdutoras de sinais, encontradas em Bacteria, archaeas fixadoras de nitrogênio e cloroplastos de eucariotos fototróficos (algas vermelhas e plantas). Em E. coli, há dois representantes da família de proteínas PII, GlnB e GlnK. Essas proteínas atuam por meio da interação proteína-proteína, regulando alvos de acordo com flutuações dos níveis de moléculas sinalizadoras do status de nitrogênio, carbono e energia. Assim, as proteínas PII são tidas como integradoras dos metabolismos de nitrogênio, carbono e energia. Recentes estudos mostraram a interação de PII com BCCP, subunidade da enzima acetil-CoA carboxilase (ACC), de forma dependente de ATP e negativamente regulada por 2- oxoglutarato (2-OG). A enzima ACC de E. coli é composta pelas subunidades BCCP, BC e CT que catalisam a formação de malonil-CoA a partir de acetil-CoA, sendo esta a primeira e irreversível etapa da biossíntese de ácidos graxos. Neste trabalho, foram obtidos resultados mostrando a formação de complexo ternário entre as proteínas PII, BCCP e BC e o efeito inibitório in vitro desta interação na atividade da ACC em E. coli. Além disso, os resultados aqui apresentados sugerem que estirpes de E. coli mutantes PII apresentam maior produção de ácidos graxos do que as células selvagens, quando sob super-expressão de uma tioesterase (TesA). Também, é mostrado neste trabalho que os níveis de malonil-CoA são diminuídos sob super-expressão de GlnB, sugerindo que as proteínas PII exercem efeito inibitório na atividade de ACC in vivo e que, assim, são funcionalmente importantes no ajuste fino na síntese de ácidos graxos de acordo com os sinais de carbono, nitrogênio e energia. Estes dados podem potencialmente contribuir para a otimização da produção microbiana de biocombustíveis por meio da engenharia genética em E. coli. Além disso, foram determinadas as condições de purificação e cristalização da enzima GlnD de E. coli. Neste organismo, GlnD catalisa a uridililação/desuridililação de PII de acordo com os níveis de glutamina, direcionando as proteínas PII a interagir com alvos específicos em resposta a este metabólito. Palavras-chave: proteínas PII, metabolismo de nitrogênio, metabolismo de carbono, ácidos graxos, acetil-CoA carboxilase, GlnD.Abstract: PII proteins are one of the most widespread family of signal transduction proteins, found in Bacteria, nitrogen-fixing Archaea and in the chloroplasts of eukaryotic phototrophs (red algae and plants). In E. coli, there are two representatives of the PII family, GlnB and GlnK. These proteins act by protein-protein interaction with target proteins. These interactions are determined according to the level of nitrogen, carbon and energy signaling molecules. Hence PII are considered as a control integrating module between the nitrogen, carbon and energy metabolisms. Recently, the interaction between PII and BCCP was shown. BCCP is a subunit of the acetyl-CoA carboxylase (ACC) enzyme and the interaction between PII and BCCP is ATP-dependent and negative regulated by 2- oxoglutarate (2-OG). E. coli ACC is a multi-subunit enzyme formed by BCCP, BC and CT subunits. ACC catalyze the first and committed step in fatty acid biosynthesis, the formation of malonyl-CoA from acetyl-CoA. In this work, we show the formation of a ternary complex between PII, BCCP and BC in vitro and the inhibitory effect of this interaction on the ACC activity in E. coli. In addition, we show that PII mutants strains have increased fatty acid productivity in comparison to E. coli wildtype, under TesA overexpression. Also, in this work it was observed that GlnB overexpression decreases the levels of malonyl-CoA when ACC was overexpressed in E. coli. Collectively these results indicate the inhibitory effect of PII over ACC activity in vivo. These data provide the basis to increase microbial biofuels production by genetic engineered E. coli. Here we also show the preliminary purification and crystallization condition of the E. coli GlnD enzyme. The GlnD enzyme uridylylates/deuridylylates PII proteins in response to glutamine levels, thereby controlling the interaction between PII proteins and specific targets. Keyworkds: PII proteins, nitrogen metabolism, carbon metabolism, fatty acids, acetyl-CoA caroboxylase, GlnD