Regulação da expressão de polihidroxialcanoato sintases em Herbaspirillum seopedicae estirpe SmR1

Orientador : Profª. Drª. Maria Berenice Reynaud SteffensCoorientador : Prof. Dr. Marcelo Müller dos SantosTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 18/05/2015Inclui referências: f. 115-136Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria da classe Betaproteobacteria que pode colonizar plantas de forma endofítica e epifítica, e promover o crescimento vegetal. Esta propriedade está relacionada à sua capacidade de fixar nitrogênio atmosférico, produzir fitormônios e colonizar o interior dos tecidos vegetais. Além disso, produz polihidroxialcanoatos (PHAs), uma classe de polímeros biodegradáveis constituídos de resíduos de ácidos 3-hidroxialcanóicos sintetizados como reserva de energia e carbono. O polihidroxibutirato (PHB) é o PHA melhor caracterizado. Este polímero é sintetizado em condições limitantes de crescimento e é armazenado na forma de grânulos no interior da célula bacteriana. O genoma de Herbaspirillum seropedicae SmR1 apresenta 13 genes potencialmente envolvidos no metabolismo de PHA, dentre os quais quatro foram anotados como codificadores de PHA sintases. O objetivo deste trabalho foi investigar o papel das PHA sintases de H. seropedicae codificadas pelos genes phaC1, 2, 3 e 4, bem como, os efeitos fisiológicos causados pela ausência deste polímero. O nível de transcrição destes genes foi avaliado nas estirpes selvagem SmR1 e ?phaC1 (deficiente na síntese de PHB), contendo fusões transcricionais com o gene repórter lacZ. Somente o promotor phaC2 no mutante ?phaC1 apresentou expressão inferior. Um possível efeito da proteína reguladora PhaR ou da proteína sensora de níveis redox, Fnr, na baixa taxa de transcrição de phaC2, na estirpe ?phaC1, foi investigado. Não houve alteração do nível de expressão dos genes phaC no mutante ?phaR. Também não houve expressão diferencial dos genes phaC1, 3 e 4 nos mutantes ?fnr, mas phaC2 foi reprimido principalmente nos mutantes fnr1 e 3. Estes resultados sugerem que a expressão do gene phaC2 seja dependente de Fnr e não de PhaR. Como o gene phaC2 apresentou baixo nível de transcrição nas estirpes ?phaC1 e ?fnr, foi investigado se a expressão diminuída de phaC2 estaria relacionada com a ausência de PHB e se esta ausência poderia afetar negativamente a atividade de Fnr. Todos os mutantes ?fnr produziram quantidades de PHB similares a estirpe selvagem SmR1 e isto indica que que é a deleção dos genes fnr que afeta a transcrição de phaC2 e não a ausência de PHB. Assim, conclui-se que é a deleção dos genes fnr que afeta a transcrição de phaC2 e não a ausência de PHB. Ensaios com fusões transcricionais fnr1-lacZ e fixNlacZ, cujas expressões dependem de Fnr, mostraram que ambos os genes apresentam expressão diminuída na estirpe ?phaC1, indicando um efeito negativo da ausência de PHB na atividade de Fnr. Em relação à fixação biológica de nitrogênio (BNF), a estirpe ?phaC1 apresentou uma redução de 89% na capacidade de reduzir o acetileno e isto indica que a mutação também interfere na BNF. Em relação à sensibilidade ao estresse oxidativo, a estirpe ?phaC1 foi mais sensível ao metilviologênio (gerador de superóxido) e produziu mais EROs que a estirpe SmR1, em condições padrão de crescimento. O ambiente desfavorável provocado pela produção mais elevada de EROs pela estirpe ?phaC1 afeta negativamente os grupamentos Fe-S das metaloproteínas como Fnr e Nitrogenase. Provavelmente, o metabolismo do PHB em H. seropedicae funcione como um ciclo que pode estocar carbono e oxidar NADPH durante sua síntese e liberar carbono e reduzir NAD+ durante sua mobilização. Este metabolismo modula a disponibilidade de equivalentes redutores que reduzem o estresse oxidativo, que é um desiquilíbrio do controle e da sinalização do estado redox. Os resultados desta Tese mostram a importância da produção de PHB no controle oxidativo e na proteção das proteínas Fnr e Nitrogenase e poderão contribuir para a elucidação do controle redox via a produção de PHB também em outras bactérias produtoras deste polímero, sugerindo uma nova função ao PHB além de estoque de carbono e energia. Palavras-chave: Herbaspirillum seropedicae; PHA sintases; PHB.Abstract: Herbaspirillum seropedicae is a bacterium that belongs to â-proteobacteria class, which is able to establish endophityc associations and to promote plant growth. This property is related to its ability to fix atmospheric nitrogen and to produce phytohormones. Furthermore, it produces polyhydroxyalkanoates (PHAs), which are a class of biodegradable polymers containing 3-hydroxyalkanoic acid monomers synthesized as a carbon and energy source. PHB is the best characterized PHA. This polymer is synthesized under limited nutrient conditions and stored as granules inside bacteria cells. The genome of H. seropedicae SmR1 revealed 13 genes potentially involved in PHA metabolism and 4 of these were annotated as PHA synthases. The aim of this work was to investigate the role of the PHA synthases from H. seropedicae encoded by phaC1, 2, 3 and 4 genes, as well as physiological effects produced by the absence of this polymer. Transcription level of these genes was evaluated in wild-type SmR1 and ÄphaC1, which does not produce PHB, carrying out lacZ transcriptional fusions. The phaC2 promoter showed lower expression only in ÄphaC1 mutant. A possible effect of transcriptional regulators PhaR and/or Fnr in lower transcription in ÄphaC1 strain was investigated. There was not expression change of phaC genes in ÄphaR mutant. There was not expression change of phaC1, 3 e 4 genes in Äfnr mutants either, but phaC2 was repressed mainly fnr1 and 3 mutants. These results suggest that phaC2 showed an Fnr-dependent expression and independent of PhaR. Since phaC2 did shown low transcription in ÄphaC1 and Äfnr mutant strains, it was investigated if low expression of phaC2 would be related to the PHB absence and/or if the lacking of PHB would affect negatively the Fnr activity. The PHB accumulation was measured in Äfnr mutants and all of them produced similar PHB moieties as compared to SmR1. Therefore, it is possible to conclude that the fnr deletions, instead the lack of PHB, affect the phaC2 transcription. Assays with fnr1-lacZ e fixN-lacZ transcriptional fusions, whose expressions depend on Fnr, showed that both genes exhibited lower expression in ÄphaC1 strain, indicating a negative effect of PHB absence in the Fnr activity. With regard to biological nitrogen fixation (BNF), ÄphaC1 strain showed an 89% reduction in acetylene reduction, indicating that the lack of PHB affects BNF as well. Concerning sensitivity to oxidative stress, the ÄphaC1 was more susceptible to methyl viologen (a superoxide generator) and produces more ROS than SmR1. The unfavorable environment created by more elevated production of ROS in ÄphaC1 strain affects negatively the Fe-S cluster of metalloproteins, such as Fnr and nitrogenase. Possibly PHB metabolism in H. seropedicae functions as cycle which can store carbon and oxidize NADPH in its synthesis and, release carbon and reduce NAD+ in its mobilization. This metabolism modulates the availability of reducing equivalents that alleviates the oxidative stress, which is a disruption of redox signaling and control. The results of this work showed the importance of PHB synthesis in oxidative control and possibly for protection of metalloproteins, and may contribute to elucidate the redox control through PHB synthesis in other PHB-accumulating bacteria, bring a new function to PHB further the carbon and energy storage. Key-words: Herbaspirillum seropedicae; PHA synthases; PHB