Caracterização fenotípica e molecular de isolados humanos e ambientais de Herbaspirillum spp.

Orientadora : Profa. Dra. Cyntia Maria Telles Fadel-PichethCo-orientadora : Profa. Drª Fabiane RegoDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 28/03/2011Bibliografia: fls. 90-99Área de concentração: Análises ClínicasResumo: Microorganismos pertencentes ao gênero Herbaspirillum têm sido amplamente estudados em relação à sua capacidade de fixar nitrogênio. Contudo o crescente isolamento destes microorganismos a partir de amostras clínicas indica o potencial para atuar como patógeno humano. Neste trabalho 15 estirpes de Herbaspirillum, oito isolados ambientais e sete isolados clínicos, foram estudadas quanto às suas características fenotípicas, moleculares e comportamento em ensaios biológicos "in vitro". Os resultados dos testes microbiológicos convencionais indicam que as bactérias do gênero Herbaspirillum poderiam ser erroneamente identificadas como Burkholderia cepacia, Ralstonia monolytica, Ochobacterum spp., Acidovorox spp. ou o grupo 2 Pseudomonas-like. Divergências nos resultados de alguns dos testes bioquímicos comuns aos sistemas convencionais e comerciais foram observadas. Nenhuma das estirpes isoladas de humanos foi capaz de fixar nitrogênio. O seqüenciamento do gene gyrB, realizado apenas para as estirpes isoladas de humanos, confirmam a classificação destes microorganismos no gênero Herbaspirillum, realizada previamente pelas análise de 16S rRNA. As análises de espectrometria de massa tipo MALDI-TOF permitiram identificar os picos (m/z) 3349,46 (3347,97-3351,38) e 6700,78 (6697,92-6702.3) comuns entre as 15 estirpes do gênero estudadas e um pico de 7313,47 (7311,92-7315,02) em comum para ambas as estirpes de H. frinsingense, que podem servir como marcadores para esse gênero e espécies. As análises de MALDI-TOF permitiram a identificação ao nível de espécie e estirpe, e são mais vantajosas e acuradas em relação aos ensaios bioquímicos. Os ensaios biológicos "in vitro" demonstraram que, nas condições utilizadas, as estirpes não apresentam ação citotóxica nem hemolítica, embora tenham sido capazes de aderir às células humanas. Os resultados obtidos indicam que as estirpes ambientais e clínicas são similares na grande maioria das características testadas, mas foram claramente distinguidas através da análise de MALDI-TOF, que pode eventualmente vir a ser a metodologia de referência para a identificação desses organismos. Os ensaios celulares sugerem que as estirpes de Herbaspirillum apresentam baixo potencial de virulência.Abstract: Microorganisms belonging to the genus Herbaspirillum have been widely studied in relation to their ability to fix nitrogen. However the increasing isolation of these microorganisms from clinical samples indicates their potential to act as a human pathogens. In these study the phenotypic characteristics and molecular behavior in biological assays in vitro of 15 strains of Herbaspirillum, eight environmental isolates and seven clinical isolates, were analyzed. Results of the conventional microbiological tests indicated that bacteria of the genus Herbaspirillum may be misidentified as Burkholderia cepacia, Ralstonia monolytica, Ochobacterum spp., Acidovorox spp. or Pseudomonas-like group 2. Discrepancies in the results of some biochemical tests common to conventional and commercial systems were observed. None of the strains isolated from humans were able to fix nitrogen. Sequencing of the gyrB gene, performed only for strains isolated from humans, confirmed the classification of these microorganisms in the genus Herbaspirillum, which was previously performed by analysis of 16S rRNA. The analysis based on MALDI-TOF mass spectrometry allowed to identify the peaks (m / z) 3349,46 (3347,97-3351,38) e 6700,78 (6697,92-6702.3) common for the 15 strains studied and one peak in 7313,47 (7311,92-7315,02) common for both strains of H. frinsingense, which may serve as markers for this genus and species. The MALDI-TOF analysis allowed the identification to species and strain level, and is more advantageous and accurate in relation to biochemical assays for this group of bacteria. Biological assays in vitro demonstrated that, in the conditions used, strains presented no cytotoxic or hemolytic activities, although they were able to adhere to human cells. The results indicate that the environmental and clinical strains were similar in most tests, but were clearly distinguished by analysis of MALDI-TOF, which may eventually become the reference methodology for the identification of organisms. The cellular assays suggested that the Herbaspirillum strains have low virulence potential