Efeito de mutaçoes nas proteínas GInB e GInZ sobre a regulaçao da fixaçao de nitrogenio em Azorpirillum brasilense

Orientador : Emanuel Maltempi de SouzaCo-orientadora : Gisele KlassenDissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2005Inclui bibliografiaResumo: Azospirillum brasilense é um diazotrofo aeróbio encontrado em associação com raízes de diversas plantas de interesse comercial. Em Azospirillum brasilense as proteínas da família PII, GlnB e GlnZ, participam da regulação do metabolismo de nitrogênio, atuando como sinalizadoras dos níveis de amônio intracelular. Mutantes glnB são incapazes de fixar nitrogênio. Neste trabalho, a participação destas proteínas no metabolismo de nitrogênio foi examinada utilizando estirpes mutantes de A. brasilense e plasmídeos expressando genes glnB e glnZ contendo mudanças discretas de um ou dois resíduos de aminoácidos nas respectivas proteínas. As estirpes mutantes utilizadas foram A. brasilense 7628 (glnB negativo), 7611 (glnZ negativo) e 2812 (glnBglnZ negativo). Os derivados dos genes glnZ e glnB de A. brasilense obtidos foram glnZY51-F, glnZI45-T,R101-C, glnBL13-P; glnBV100-A. Os resultados obtidos revelaram que GlnB é essencial para a regulação normal de sistema Ntr, provavelmente regulando a concentração de NtrC-P de acordo com os níveis celulares de amônio. A proteína GlnZ, por outro lado, aparentemente substitui parcialmente GlnB no mutante 7628. Os resultados mostraram também que resíduo V100 da proteína GlnB é importante, embora não essencial, para a interação de GlnB com NtrB, uma vez que essa proteína mutante complementou parcialmente o mutante glnB negativo de A. brasilense. Entretanto, o gene mutante glnBV100-A não complementou o fenótipo Nif negativo do mutante 7628, sugerindo que esta forma de GlnB não interage com a proteína NifA de A. brasilense. O resíduo L13 é essencial para a atividade de GlnB: a sua substituição por P causa a perda da capacidade de GlnB ativar NifA e sinalizar níveis de nitrogênio para o sistema Ntr. O plasmídeo contendo o gene mutante glnZY51-F não foi capaz de complementar o fenótipo de reativação da nitrogenase após choque de amônio (0,2 mmol/L) e o transporte de metil amônio no mutante glnZ negativo 7611 de A. brasilense, sugerindo que a uridililação desta proteína é essencial para a sinalização dos níveis de nitrogênio intracelular no sistema DraT/DraG e para o transporte de amônio. Os resíduos I45 e R101 da proteína GlnZ, altamente conservados nas proteína da família PII, são importantes para a transdução de sinal para o sistema DraT/DraG, mas não alteraram a capacidade de GlnZ em controlar o transporte de metilamônio em A. brasilense. O desligamento parcial da nitrogenase por adição de íons amônio do mutante AmtB reforça a hipótese da existência de um segundo sistema de transporte de amônio em A. brasilense. Os resultados desse trabalho reforçam a diferença funcional das proteínas PII de A. brasilense e apoiam a sugestão de que GlnB é o regulador primário da atividade do sistema de dois componentes NtrB-NtrC e que GlnZ controla o transporte de amônio de alta afinidade via AmtB. Finalmente, a análise do conjunto dos resultados implica que a concentração intracelular destas proteínas e a regulação temporal de sua síntese são elementos importantes de controle de suas atividades.RESUMO: Azospirillum brasilense é um diazotrofo aeróbio encontrado em associação com raízes de diversas plantas de interesse comercial. Em Azospirillum brasilense as proteínas da família PII, GlnB e GlnZ, participam da regulação do metabolismo de nitrogênio, atuando como sinalizadoras dos níveis de amónio intracelular. Mutantes glnB são incapazes de fixar nitrogênio. Enquanto que mutantes glnZ são capazes de fixar nitrogênio. Neste trabalho, a participação destas proteínas no metabolismo de nitrogênio foi examinada utilizando estirpes mutantes de A. brasilense e plasmídeos expressando genes glnB e glnZ contendo mudanças de uma ou duas bases. As estirpes mutantes utilizadas foram A. brasilense 7628 (glnB negativo), 7611 (glnZ negativo) e 2812 (glnBglnZ negativo). Os derivados dos genes glnZ e glnB de A. brasilense obtidos foram g/"ZY51-F, g/"ZI45-T,R101-C, g/"i?L13-P; glnBV 100-A. Os resultados obtidos revelaram que GlnB é essencial para a regulação normal de sistema Ntr, provavelmente regulando a concentração de NtrC-P, de acordo com os níveis celulares de amónio. A proteína GlnZ, por outro lado, aparentemente substitui parcialmente GlnB no mutante 7628. Os resultados mostraram também que resíduo V I00 da proteína GlnB é importante, embora não essencial, para a interação de GlnB com NtrB, uma vez que essa proteína mutante complementou parcialmente o mutante glnB negativo de A. brasilense. Entretanto, o gene mutante glnBVlOO-A não complementou o fenótipo N if negativo do mutante 7628, sugerindo que esta forma de GlnB não interage com a proteína NifA de A. brasilense. O resíduo L13 é essencial para a atividade de GlnB: a sua substituição por P causa a perda da capacidade de GlnB ativar NifA e sinalizar níveis de nitrogênio para o sistema Ntr. O plasmídeo contendo o gene mutante glnZY51-¥ não foi capaz de complementar o fenótipo de reativação da nitrogenase após choque de amónio (0,2 mmol/L) e o transporte de metilamônio no mutante glnZ negativo 7611 de A. brasilense, sugerindo que a uridililação desta proteína é essencial para a sinalização dos níveis de nitrogênio intracelular no sistema DraT/DraG e para o transporte de amónio. Os resíduos 145 e R101 da proteína GlnZ, altamente conservados nas proteína da família PII, são importantes para a transdução de sinal para o sistema DraT/DraG, mas não alteraram a capacidade de GlnZ em controlar o transporte de metilamônio em A. brasilense. O desligamento parcial da nitrogenase por adição de íons amónio do mutante AmtB reforça a hipótese da existência de um segundo sistema de transporte de amónio em A. brasilense. Os resultados desse trabalho reforçam a diferença funcional das proteínas PII de A. brasilense e apóiam a sugestão de que GlnB é o regulador primário da atividade do sistema de dois componentes NtrBNtrC e que GlnZ controla o transporte de amónio de alta afinidade via AmtB. Finalmente, a análise do conjunto dos resultados implica que a concentração intracelular destas proteínas e a regulação temporal de sua síntese são elementos importantes de controle de suas atividades