Aplicação de ferramentas de engenharia metabólica em Herbaspirillum seropedicae Smr1 para aumento na produção de polihidroxibutirato

Orientador : Prof. Dr. Marcelo Müller dos SantosDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 29/09/2016Inclui referências : f. 83-92Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma proteobacteria endofítica e fixadora de nitrogênio capaz de acumular polihidroxibutirato. O polihidroxibutirato é um poliéster produzido por diversos tipos de bactéria e é utilizado como reserva de carbono além de atuar na resposta ao estresse ambiental. Este polímero vem sendo utilizado como substituto a materiais plásticos derivados de petróleo, graças as suas características termoplásticas semelhantes às do polipropileno e polietileno e, também devido a sua alta biodegradabilidade. A biossíntese do polímero é altamente dependente da concentração do cofator NADPH. Este estudo visa avaliar estratégias para melhoria na produção de PHB por Herbaspirillum seropedicae SmR1 através da aplicação de técnicas de engenharia metabólica. As estratégias testadas consistem na expressão de genes heterólogos gnd de Escherichia coli MG1655 e gap2 de Synechococcus elongatus PCC 7942, sob controle de promotores endógenos, para modificar os fluxos do metabolismo central de carbono de H. seropedicae de forma a gerar mais cofator reduzido por molécula de substrato consumida. Os genes gnd e gap2 codificam a 6-fosfogluconato desidrogenase e a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase NADP+-dependente, respectivamente. Ambas as enzimas geram NADPH como subproduto e não tem homólogos correspondentes no genoma de H. seropedicae SmR1. Observou-se que a expressão dos genes afeta de forma negativa o crescimento e pode provocar mutações, sendo tais fenótipos dependentes da atividade dos genes heterólogos e por consequência, da força da transcrição dos mesmos. Realizando experimento de evolução induzida com a estirpe expressando gnd, obteve-se um mutante com capacidade de crescimento superior a estirpe selvagem, que ainda mantem a atividade do gene e maior produtividade de PHB.Abstract: Herbaspirillum seropedicae is an endophytic betaproteobacteria capable to fix nitrogen and to accumulate polyhydroxybutyrate. Polyhydroxybutyrate is a kind of polyester produced by a variety of bacteria, serving as energy reserve and is involved in the environmental stress response of the bacteria. This polymer is used as substitute for oil-based plastics, due to its similar thermoplastic proprieties and fast biodegradability in the environment. The PHB biosynthesis is highly dependent on intracellular NADPH concentration. This study evaluated the expression of NADPH-generating enzyme as an strategy to increase PHB production in Herbaspirillum seropedicae SmR1 through metabolic engineering. Strategies applied in this study involve heterologous expression of gnd from Escherichia coli MG1655 and gap2 from Synechococcus elongatus PCC 7942, under control of endogenous promoter sequences in order to modify the carbon flux through the central carbon metabolism of H. seropedicae in order to generate extra NADPH molecules per substrate of molecule consumed. It was not identified any homologous to these genes in the genome of H. seropedicae SmR1 and we have observed that the expression of such genes severely depressed growth and stimulated the occurrence of mutation. These phenotypes are strongly correlated with heterologous gene activity, and as consequence, with the transcriptional strength of the promoters. By performing induced evolution experiments, we have obtained a mutant capable of superior growth relative to the parental strain, which still exhibits heterologus gene activity as well as increased productivity of PHB