Otimização do processo de produção de proteínas recombinantes de Mycobacterium tuberculosis em Escherichia coli para uso em diagnóstico de tuberculose

Orientador : Prof. Dr. Vanete Thomaz SoccolTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 17/04/2014Inclui referências : f. 122-133Área de concentração: Saúde humana e animalResumo: O presente trabalho teve por objetivo produzir insumos para auxílio no diagnóstico de tuberculose, elaborados a partir de proteínas recombinantes específicas de Mycobacterium tuberculosis (CFP10 e ESAT6), obtidas por expressão heteróloga em Escherichia coli e aplicáveis em produção industrial. Para parametrização da fase inicial de cultivo celular definiu-se a concentração do pré-inóculo (1:10000) e o tempo de fermentação (12 horas) garantindo a maior porcentagem de viabilidade do plasmídeo ancorada à bactéria. Os valores de ciclos de rompimento celular, solubilização e as condições de cultivo (concentração IPTG, temperatura de crescimento e indução) foram determinados a partir de planejamento experimental fatorial completo 23, avaliando como variável resposta a concentração das proteínas recombinantes. Os melhores resultados foram obtidos com a utilização de 12 ciclos de rompimento e sete ciclos de solubilização. Para as condições de cultivo celular definiu-se a concentração de 0,1 mM de IPTG e a temperatura de fermentação de 26°C. Na produção em biorreator de 10L obteve-se concentrações de 232,59 mg/mL e 120,79 mg/mL das proteínas CFP10 e ESAT6, respectivamente. A estimativa de custo foi de R$ 0,46 por mg de proteína para a primeira e de R$1,11 por mg de proteína para a segunda. Para estudo da estabilidade a apresentação liofilizada apresentou melhor resultado. A avaliação de resposta imune humoral das proteínas recombinantes produzidas foi realizada com testes ELISA e Western blot. As duas proteínas avaliadas por ELISA apresentaram valores 51,0 e 41,4 vezes a diferença entre o controle positivo e negativo. E sua especificidade foi comprovada em Western Blot. As proteínas recombinantes também foram capazes de produzir IFN-? quando utilizadas na estimulação de células mononucleares de pacientes infectados com M. tuberculosis. A resposta celular de intradermorreação em cobaios (Cavia porcellus) foi avaliada para as duas proteínas recombinantes que produziram reação positiva de enduração nos animais sensibilizados com M. tuberculosis e M. bovis. Nos animais não sensibilizados e sensibilizados com M. avium e M. bovis BCG não houve reação, mostrando a alta especificidade das proteínas. Quando aplicadas combinadas, na concentração de 0,04 mg/mL, os resultados de enduração foram significativamente superiores aos obtido pelo PPD padrão. O alto rendimento obtido no cultivo celular e a estabilidade da forma de apresentação liofilizada tornam a metodologia aplicável industrialmente. Estes insumos têm aplicação em diagnósticos, além de fomentar o desenvolvimento tecnológico nacional com a produção de um teste nacional com alta especificidade e sensibilidade. Palavras chaves: Proteínas recombinantes; Mycobacterium tuberculosis; PPD recombinante; tuberculose; diagnóstico.Abstract: The present work aims producing inputs to support tuberculosis diagnosis, elaborated from specific Mycobacterium tuberculosis recombinant proteins (CFP10 and ESAT6), obtained by heterologous expression in Escherichia coli to an applicable industrial production. To parameterize the initial phase of the fermentation, the pre-inoculum concentration (1:10000) and the fermentation time (12 hours) were defined, securing greater percentage of feasibility from the plasmid anchored to the bacteria. The cell disruption cycle, solubilization and the growth conditions (IPTG concentration, growth and induction temperatures) were determined by the 23 in a complete factorial experimental planning, evaluating as variable the concentration of recombinant proteins. The best results were obtained by using 12 disruption cycles and seven solubilization cycles. For the fermentation conditions, it was defined a concentration of 0.1 mM IPTG and 26°C as fermentation temperature. The production of heterologous proteins conducted in bioreactor was successfully performed, and concentrations of 232.59 mg/mL and 120.79 mg/mL were respectively obtained for proteins CFP10 and ESAT6. The cost estimate per protein mg was R$ 0.46 for the first one, and R$ 1.11 for the second one. The lyophilized presentation form showed greater stability. The humoral immune response evaluation to the produced recombinant proteins was performed through ELISA and Western blot tests. The first two evaluated proteins by ELISA presented values of 51 and 41.4 times the difference between positive and negative controls. Its specificity was also proved in Blot. The recombinant proteins were also capable of producing IFN-? when used in the stimulation of mononuclear cells from infected patients. The intradermoreaction cellular response in guinea pigs (Cavia porcellus) was evaluated, both recombinant proteins produced positive induration reaction in the sensitized animals with M. tuberculosis e M. bovis. Nevertheless, in non-sensitized and sensitized animals with M.avium e M. bovis BCG there was no reaction. When combined, at the concentration of 0.04 mg/mL, the induration results were significantly higher than the ones obtained by standard PPD. The fermentation high yield and the lyophilized form stability make the methodology applicable at the industry. These inputs can be applied to diagnosis, besides fomenting the national technological development by the production of a national test with high specificity and sensitivity. Keywords: recombinant proteins; Mycobacterium tuberculosis; recombinant PPD; tuberculosis; diagnosis