Avaliação dos efeitos biológicos induzidos por polissacarídeos extraídos de algas em linhagem B16-F10 (Melanoma murino)

Orientadora: Profª Drª. Célia Regina Cavichiolo FrancoCoorientador: Prof. Dr. Edvaldo da Silva TrindadeDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 05/04/2016Inclui referências: p.88-98Resumo: Nas três últimas décadas, o câncer vem alterando o perfil epidemiológico do país. Este evento caracteriza-se pelo aumento dos agravos e da mortalidade provenientes de doenças não transmissíveis, pelo aumento da expectativa de vida com números cada vez maiores de idosos em detrimento ao número de jovens, e por uma predominância da morbidade em relação à mortalidade, gerando grandes impactos no sistema de saúde e na economia. Apesar do conhecimento de que a luz Ultra Violeta é o principal fator ambiental relacionado ao câncer do tipo melanoma, modelo de estudo do presente estudo, os mecanismos pelos quais este deflagra a doença, bem como os componentes genéticos associados a esta patologia, não estão totalmente esclarecidos. A ciência busca compostos naturais para a cura de inúmeras doenças, e as pesquisas científicas têm sido intensificadas com o objetivo de investigar a ação farmacológica de diferentes produtos naturais, os quais tenham papel promissor no tratamento do câncer. Nosso objetivo é avaliar o potencial biológico de uma galactana sulfatada extraída da alga verde Codium Isthmocladum (CI), e de uma heteroramnana extraída da alga verde Gayralia brasiliensis (GB), em diferentes concentrações e tempos de tratamento, empregando ensaios in vitro com células das linhagem B16-F10 e RAW 264.7, melanoma e macrófago murino, respectivamente. Polissacarídeos com efeitos medicinais já foram e ainda são amplamente encontrados e descritos em fungos (majoritariamente em cogumelos), plantas, algas, animais e bactérias, sendo que a atividade desses compostos está intimamente associada a sua estrutura química, como composição monossacarídica, peso molecular e modificação de grupos funcionais. Entre suas diversas funcionalidades biológicas, são descritas atividades antitumorais através de inibição do crescimento tumoral, inibição de angiogênese, indução de apoptose, aumento de imunocompetência, diminuição de capacidade metastática e desencadeamento da perda de viabilidade celular. A galactana aqui estudada demonstrou diminuir a viabilidade celular (detectada pelo método de vermelho neutro) da linhagem em estudo no período de exposição de 72h em todas as concentrações testadas (1, 10, 100 e 1000ug/mL), não gerando comprometimento da atividade mitocondrial (ensaio de MTT) nas mesmas condições. Nos mesmos ensaios e condições de tratamento, a heteroramnana em estudo demonstrou comprometer a viabilidade celular e a atividade mitocondrial da linhagem B16-F10 nos três tempos testados (24, 48 e 72h) em pelo menos uma das concentrações. Ambos os polissacarídeos diminuíram a proliferação celular em 48h de tratamento. Com estes resultados, as concentrações de 10 e 100ug/mL e o tempo de tratamento de 72h foram escolhidos para o prosseguimento dos experimentos. Nestes parâmetros de tratamento, os polissacarídeos não comprometeram o potencial de membrana mitocondrial, além de não gerar arrasto do ciclo celular. A análise da morfologia celular em microscopia eletrônica de varredura apresentou alterações nas células tratadas com ambos os compostos. O ensaio de migração celular demonstra um promissor comprometimento dessa mecânica quando a linhagem B16-F10 foi exposta ao polissacarídeo GB. Entre as possíveis explicações para essa modulação, a marcação do receptor CD44 diminuiu de forma estatisticamente significativa frente ao tratamento com o polissacarídeo GB. Ambos os compostos aumentaram a marcação de CD54 e a produção de espécies reativas de oxigênio em macrófagos, o que pode indicar diferenciação dessas células na ativação clássica M1. Assim, esses polissacarídeos apresentaram resultados promissores frente as linhagem em estudo, porém outros experimentos in vitro e in vivo devem ser realizados para se identificar as biomoléculas envolvidas, bem como rotas e vias que possam estar sendo moduladas frente aos tratamentos com esses compostos. PALAVRAS CHAVE: melanoma, polissacarídeos, Codium isthmocladum,Gayralia brasiliensis, B16-F10, RAW 267.4, algas verdes.Abstract: In the last three decades, cancer is changing the epidemiological profile of the country. This event is characterized by the increase in diseases and mortality from non-communicable diseases, increased life expectancy with increasing numbers of elderly people over the number of young people, and a predominance of morbidity in relation to mortality, generating major impact on the health system and the economy. Despite the knowledge that UV light is the main environmental factor related to cancer of the melanoma type, model of this study, the mechanisms by which this triggers the disease and the genetic components associated with this disease are not fully understood. Science seeks natural compounds for curing numerous diseases and scientific research has been intensified in order to investigate the pharmacological action of different natural products, which have promising role in treating cancer. Our goal was to assess the biological potential of an extracted sulphated galactan from the green alga Codium Isthmocladum, and an extracted heteroramnana from the green alga Gayralia brasiliensis, both at different concentrations and treatment times (exposure), using in vitro assays with murine melanoma cells B16-F10 lineage and RAW 264.7 macrophage lineage. Polysaccharides with medicinal effects are widely found and described in fungi (mainly in mushrooms), plants, algae, animals and bacteria, where the activity of these compounds is closely related to its chemical structure, such as monosaccharide composition, molecular weight and modification of functional groups. Among its various biological functions, antitumor activity are described by inhibiting tumor growth, inhibiting angiogenesis, induction of apoptosis, increased immunocompetence, decreased metastatic capacity and outbreak of loss of cell viability. The galactan studied here shown to decrease cell viability (detected by the neutral red method) of the lineage under study at 72h exposure period in all tested concentrations (1, 10, 100 and 1000?g/ml),and not genetare impairment of mitochondrial activity (MTT assay) in the same conditions. In the same tests and conditions of treatment, the heteroheteroramnana under study demonstrated compromising cell viability and mitochondrial activity of B16-F10 line in the three times tested (24, 48 and 72h) in at least one of the concentrations. Both polysaccharides decreased cell proliferation at 48 hours of treatment. With these results, the concentrations of 10 and 100?g/mL and 72h treatment time were chosen for further experiments. In these treatment parameters, polysaccharides did not affect the mitochondrial membrane potential, as well as not to generate cell cycle arrest. The analysis of cell morphology in scanning electron microscopy showed changes in cells treated with both compounds. The cell migration assay demonstrates a promising commitment of this mechanic when the B16-F10 lineage was exposed to the polysaccharide GB. Among the possible explanations for this modulation, the immunostaining of the CD44 receptor statistically significantly decreased toward the treatment with the polysaccharide GB. Both compounds increased the immunostaining of CD54 and production of reactive oxygen species in macrophages, which may indicate differentiation of cells in classical activation (M1). Thus, these polysaccharides have shown promising results against the lineages under study, but other experiments in vitro and in vivo should be conducted to identify the biomolecules involved , as well as routes and signaling pathways that may be being modulated by the treatments with these compounds. KEYWORDS : melanoma, polysaccharides , Codium isthmocladum , Gayralia brasiliensis , B16 -F10 , RAW 267.4, green algae