Análise metagenômica do microbioma do intestino e dos coprólitos das minhocas Perionyx excavatus e Dichogaster annae

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Leda S. ChubatsuCoorientador: Dr. George G. BrownTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências – Bioquímica. Defesa : Curitiba, 23/02/2018Inclui referências: p.117-130Resumo: A contribuição das minhocas no processo de decomposição da matéria orgânica tem ganhado relevância devido à busca de um melhor gerenciamento dos resíduos orgânicos. As alterações na composição das comunidades microbianas durante o trânsito do solo e da matéria orgânica pelo intestino desempenham um papel importante no processo de decomposição. Assim, a identificação dos microrganismos presentes nas diferentes porções do intestino e do coprólito das espécies de minhoca Perionyx excavatus e Dichogaster annae poderá contribuir para um melhor entendimento da importância funcional da comunidade bacteriana entérica e excretada por ela. Além disso, permite a busca por grupos bacterianos que podem ter desenvolvido relação mutualística ou simbiótica com as minhocas. A fim de descrever a comunidade bacteriana do conteúdo das três porções do intestino, do coprólito e do alimento ofertado às minhocas (substrato) adotou-se a abordagem de sequenciamento do gene 16S rRNA, utilizando a plataforma MiSeq Illumina. Os resultados indicam uma distinta separação da diversidade entre as comunidades bacterianas do substrato e aquelas das minhocas. As comunidades nas regiões anterior e média são similares entre si, enquanto a comunidade da região posterior é similar à do coprólito. Os filos Proteobacteria e Bacteroidetes são mais abundantes no substrato, sendo suas quantidades diminuídas durante a passagem nas regiões anterior e média do intestino e voltando a aumentar na região posterior. No entanto, a composição das classes no substrato e na região posterior é diferente, havendo prevalência da classe Gammaproteobacteria na região posterior. Os filos TM6, Planctomycetes e Chlamydiae foram mais abundantes nas comunidades intestinais das minhocas, principalmente nas regiões anterior e media. O táxon TM6 foi encontrado estritamente no intestino de minhoca. Para explorar o potencial funcional da comunidade bacteriana do intestino dessas espécies de minhoca foram empregadas duas abordagens de sequenciamento total: o DNA total (metagenoma) e o RNA (metatranscriptoma). Ambos os sequenciamentos foram realizados utilizando a plataforma Ion Torrent. Toda a região do intestino possui potencial para a digestão da matéria orgânica embora os dados indiquem diferentes níveis de digestão nas diferentes regiões. Os dados do metatranscriptoma mostraram genes transcritos para o metabolismo central como DNA, RNA, metabolismo de proteínas e energia. Além da transcrição dos genes para a fermentação pela via do succinato. Este trabalho destaca a utilidade da abordagem metagenômica para a investigação da microbiota do intestino de minhoca. No presente trabalho foi possível verificar que existe uma diferença entre a comunidade microbiana do intestino da minhoca e do que é ingerido por ela. A mudança na comunidade bacteriana foi diferente para cada espécie de minhoca. Existe evidência de uma microflora vinculada à minhoca. Além disso, foi possível verificar a grande versatilidade metabólica da região posterior do intestino das minhocas alvos do estudo para a fermentação da matéria orgânica, sendo que nas condições estudadas, a via do succinato está sendo transcrita. Palavras Chaves: Metagenoma, Metatranscriptoma, Microbiota, Minhoca.Abstract: Earthworms' contribution in processing organic matter decomposition has been raising its relevance due to the search for a better management of organic waste. Changes in microbial communities' composition during the transit of soil and/or organic matter through the earthworm gut play an important role in the decomposition process. Therefore it is important to identify which microorganisms are present in the different portions of earthworm gut and its cast in order to understand earthworm influence upon the soil bacterial community. In addition, it is possible to look for bacterial groups that may have developed a mutualistic or symbiotic relationship with earthworms. In this work we analyzed two epigeic earthworm species: Perionyx excavatus and Dichogaster annae. High throughput DNA sequencing approach was performed to assess the microbial communities of three portions of earthworm gut, their cast and the substrate used for their feeding. Bacterial biodiversity was accessed through the analyses of the 16S rRNA gene using the Illumina MiSeq platform. Results indicated distinct bacterial community between the substrate and those of the earthworms. Foregut and midgut showed higher similarity as well as the hindgut and cast. Phyla Proteobacteria and Bacteroidetes were more abundant in substrate whereas a decrease was observed through the foregut and midgut, increasing again whithin the hindgut. However, class composition was different between substrate and hindgut with a prevalence of Gammaproteobacteria in the hindgut. TM6, Planctomycetes and Chlamydiae phyla were more abundant in earthworm specimens, mainly in the foregut and midgut. The TM6 taxon was found only to the earthworm gut. In order to explore the functional potential of the intestinal bacterial community of these earthworm species, two global DNA sequencing approaches were employed: total DNA (metagenome) and RNA (metatranscriptome). Both DNA sequencing were performed using the Ion Torrent platform. Results indicated that the earthworm gut has potential for digestion of organic matter although data indicate different levels of digestion in different gut regions. Metatranscriptome data showed transcribed genes for central metabolism such as DNA, RNA, protein metabolism and energy. This work highlights the utility of the metagenomic approach for the investigation of the earthworm gut microbiota. In the present work it was possible to verify that there is a difference between the microbial community of the earthworm gut and what is ingested by it. The change in bacterial community structure was different for each earthworm species. There is evidence of a microflora linked to earthworm. In addition, it was possible to verify the great metabolic versatility of hindgut of earthworms for fermentation of organic matter. Key-words: Metagenome, Metatranscriptome, Microbiota, Earthworms